痤疮丙酸杆菌刺激人真皮成纤维细胞后基质金属蛋白酶-2表达的研究

摘要

目的:探讨痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes，P.acnes）刺激人真皮成纤维细胞（human dermal fibroblasts，HDF）后基质金属蛋白酶-2（matrix metalloprotainase-2，MMP-2）的表达情况，以及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）在其中的作用，从而进一步了解痤疮炎症及炎症后基质重塑的机理并为痤疮的治疗提供一些新的思路。　　方法:1、标本来自本院激光室行包皮环切术的正常人，将其包皮组织洗涤，去除表皮及皮下组织，将真皮剪成碎块，胰蛋白酶消化后分离出细胞接种到培养基中，置于5％CO2、37℃培养箱中培养。观察细胞形态，经免疫荧光鉴定确认为HDF。培养并传代，将第5-18代用于实验。2、P.acnes在37℃的厌氧条件下培养48小时，挑取菌落悬浮于磷酸盐缓冲盐水(phosphatebuffered saline，PBS)中离心洗涤，在冰上超声裂解，以0.22μm微孔滤膜过滤得到细菌裂解液。3、采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)分别于3h、6h、12h检测1mg/ml、0.1mg/mlP.acnes裂解液刺激HDF后产生的TNF-α值。4、分别用1mg/ml的P.acnes裂解液、10ng/ml的TNF-α刺激HDF24h，用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞MMP-2的表达情况。5、用1mg/ml、0.1 mg/ml P.acnes裂解液、10ng/ml、1 ng/ml TNF-α及1ng/ml抗TNF-α抗体过夜后加1mg/ml P.acnes裂解液分别于不同时间刺激HDF，采用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR)和免疫印迹法(western blot)检测在信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）水平、蛋白水平上HDF细胞内MMP-2的表达情况。　　结果:1、接种次日倒置显微镜下可见有长梭形细胞迁出、贴壁生长。7-10天进行传代，传代后约5天长满，可长期传代。免疫荧光示波形蛋白(Vimentin)阳性率达99％，细胞鉴定为HDF。2、P.acnes在37℃的厌氧条件下培养48小时长出明显菌落。3、1mg/ml、0.1mg/ml P.acnes裂解液按时间梯度3h、6h、12h刺激HDF，ELISA法检测HDF细胞产生的TNF-α值较空白对照组均有不同程度增加，统计学上有显著性差异(P＜0.05)，TNF-α值在3h逐渐升高，6h达到高峰，12h逐渐下降。1mg/ml P.acnes裂解液组较0.1mg/mlP.acnes裂解液组所产生的TNF-α值更高，统计学上有显著性差异(P＜0.01)。4、激光扫描共聚焦显微镜观察发现，P.acnes裂解液和TNF-α刺激HDF后MMP-2的荧光强度较空白对照组增强，MMP-2可在HDF胞浆内表达。5、1 mg/ml P.acnes裂解液、10ng/ml TNF-α按时间梯度6h、12h、24 h刺激HDF，real-time PCR和western blot结果显示HDF细胞内MMP-2的mRNA和蛋白表达水平较空白对照组均有不同程度的增加，统计学上有显著性差异(P＜0.05)，且增加程度具有时间相关性，MMP-2在1mg/ml P.acnes裂解液、10ng/ml TNF-α作用6h左右时逐渐升高，24h左右达到高峰。6、1mg/ml、0.1 mg/mlP.acnes裂解液刺激HDF24h，MMP-2的表达出现上调，与空白对照组相比统计学上有显著性差异(P＜0.05)，并存在剂量相关性，1mg/mlP.acnes裂解液组较0.1 mg/ml P.acnes裂解液组所产生的MMP-2值更高，两组比较统计学上有显著性差异(P＜0.05)。7、10ng/ml、1ng/ml TNF-α刺激HDF24h，MMP-2的表达出现上调，与空白对照组相比统计学上有显著性差异(P＜0.05)，且存在剂量相关性，10ng/ml TNF-α组较1ng/ml TNF-α组所产生的MMP-2值更高，统计学上有显著性差异(P＜0.01)。8、细胞预先用1ng/ml抗TNF-α抗体过夜处理后，予1mg/ml P.acnes裂解液刺激HDF24h，其MMP-2的表达量较未加抗TNF-α抗体组减少，统计学上有显著性差异(P＜0.01)。　　结论:1、P.acnes裂解液刺激HDF后可引起TNF-α含量的增加。2、P.acnes裂解液及TNF-α刺激HDF后均可引起MMP-2的mRNA和蛋白表达增加，并具有时间或剂量相关性。3、抗TNF-α抗体可抑制P.acnes诱导MMP-2的表达，推测在HDF中P.acnes是通过介导TNF-α诱导MMP-2的表达。

目录

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 主要实验试剂

3 实验方法

结果

1 HDF的培养及鉴定

2 痤疮丙酸杆菌的培养

3 ELISA法检测1mg／ml、0．1mg／ml P．acnes裂解液于3、6、12h刺激HDF后TNF-α表达的结果

4 激光扫描共聚焦显微镜观察1mg／ml P．acnes裂解液、10ng／ml TNF-α刺激HDF后MMP-2的表达

5 real-time PCR法检测不同浓度Pacnes裂解液、TNF-α于不同时间刺激HDF后MMP-2 mRNA水平的变化

6 western blot法检测不同浓度P．acHes裂解液、TNF-α于不同时间刺激HDF后MMP-2蛋白水平的变化

讨论

1 P．aches的炎症致病机制

2 基质金属蛋白酶

3 P．acnes及TNF-α对HDF中MMP-2表达的影响

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

基质金属蛋白酶-2与皮肤病的研究进展 综述

声明

攻读硕士学位期间发表的论文