痰瘀同治方药抑制人结肠腺癌CacO-2细胞胆汁酸吸收的机制研究

摘要

研究背景及目的：　　动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)被看作是导致急性心脑血管事件发生发展最主要的病因，其核心病理表现为富含脂质的斑块，目前尚缺乏可快速稳定和消退斑块的措施。根据中医理论，AS属于痰瘀互结的范畴，脉络被腹中之痰浊所阻塞后，日久营血瘀滞，就此形成痰浊瘀血相凝之结块。本课题组前期实验证实：“痰瘀同治”方药（下文简称复方中药）可有效抑制AS的进展，但机制与他汀不同。已知胆汁酸肠肝循环是体内胆固醇代谢的关键环节，重吸收的胆汁酸是机体生成胆固醇的重要前体，故经肠道重吸收入血的胆汁酸也可被视为“腑中之痰浊”。我们前期研究发现：复方中药干预AS模型小鼠后，可显著抑制胆汁酸的重吸收，加速其自粪便排出，同时保持末端回肠粘膜结构完整。故此，本研究目的在于探究“痰瘀同治”方药祛除腹中痰浊抑制AS发生和发展的新机制，为传统中医药防治心脑血管疾病提供新策略和新方法。　　研究方法：　　1、人结肠腺癌Caco-2单层细胞模型建立及评价：于Transwell细胞小室内接种Caco-2细胞，培养至21天，此过程中通过不同时间点连续监测跨上皮细胞电阻(transepithelial electrical resistance，TEER)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性的变化来明确单层细胞构建成功，将细胞随机分为空白对照组、胆汁酸刺激组及复方中药预干预+胆汁酸刺激组。　　2、复方中药对Caco-2细胞胆汁酸吸收的影响：1）复方中药对胆汁酸跨膜转运作用的研究：通过柱前衍生反相高效液相色谱法(reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)定量分析各组Caco-2单层细胞模型对胆汁酸的跨膜转运情况;2）复方中药对胆汁酸吸收作用机制的研究：基于上述细胞模型，各组给予不同处理后，通过qRT-PCR和Western Blot定量分析细胞内胆汁酸吸收相关基因mRNA及蛋白的表达水平。　　3、复方中药对Caco-2单层细胞模型屏障功能及细胞氧化应激水平的影响：1)复方中药对Caco-2细胞屏障功能保护作用的研究：在上述Caco-2细胞模型中，各组给予不同处理后，评估各组荧光染料渗透率和TEER的变化，分析上述干预对Caco-2单层细胞渗透性的影响;随后通过qRT-PCR和Western Blot分析细胞间紧密连接相关基因mRNA及蛋白表达水平的变化;2）复方中药对细胞氧化应激水平影响的研究：通过荧光探针法和流式细胞术定量分析上述Caco-2单层细胞模型中ROS的生成以及凋亡的差异。　　研究结果：　　1、Caco-2单层细胞模型的建立及评价：Transwell小室内培养Caco-2细胞9天时TEER值已达到(510.93±44.54)Ω·cm2，当细胞培养至19天和21天时，TEER值显著高于500Ω·cm2的模型建立标准。Caco-2细胞培养至8天时，单层细胞顶端(apical side，AP)ALP活性与底端(basolateral side，BL)相比显著升高(P＜0.05)，当细胞培养至19天与21天时，Transwell小室两侧ALP活性的比值进一步扩大，达到2.68∶1、3.44∶1。　　2、复方中药抑制胆汁酸吸收的作用机制研究：1）与相应的胆汁酸刺激组相比，复方中药预处理可以显著降低胆酸(cholic acid，CA)、甘氨胆酸(glycocholic acid，GCA)以及牛磺胆酸(taurocholic acid，TCA)在Transwell细胞小室下室中的浓度(P＜0.05)，但对DCA无显著作用(P＞0.05);2)究其机制而言，复方中药预处理可对抗CA、GCA以及TCA三者导致的Caco-2细胞顶端钠依赖性胆汁酸转运体(apical sodium dependent bile acid transporter，ASBT)、有机溶质转运体β(organic solute transporter，OSTβ)mRNA及蛋白表达水平的升高(P＜0.05)，但对回肠胆汁酸结合蛋白(ileal bile acid binding protein，IBABP)的mRNA表达无显著影响(P＞0.05);复方中药预处理对脱氧胆酸(deoxycholic acid，DCA)刺激所引起的ASBT和OSTβmRNA及蛋白表达水平的改变无显著影响(P＞0.05)，但可对抗IBABP mRNA表达水平的下降(P＜0.05);复方中药预处理可对抗GCA以及TCA所导致的OSTαmRNA表达水平的升高(P＜0.01)，但对CA、DCA无显著影响(P＞0.05)，提示：复方中药可有效抑制Caco-2细胞对胆汁酸的吸收，但对于不同胆汁酸其抑制作用和机制有所差异。　　3、复方中药对肠道上皮细胞屏障功能保护作用的研究：1）与单纯胆汁酸刺激组相比，复方中药预处理可显著抑制CA、DCA以及GCA导致的细胞渗透性增加(P＜0.05)以及TEER值的降低(P＜0.05)，上述保护作用伴随紧密连接蛋白中咬合蛋白(occludin，Ocln)和闭锁小带蛋白2(zonula occluden2，ZO2)mRNA及蛋白表达水平的显著上调(P＜0.05)，但对TCA刺激所导致的改变无显著影响(P＞0.05);2)在闭合蛋白1(claudin1，Cldn1)mRNA的调控方面，复方中药预处理可显著改善GCA和TCA导致的表达降低(P＜0.01)，但对CA和DCA的病理作用无显著影响(P＞0.05);在ZO1mRNA的调控方面，复方中药预处理可显著改善DCA、GCA和TCA导致的表达降低(P＜0.01)，但对CA无显著影响(P＞0.05);3)复方中药预处理可显著降低CA、DCA和GCA刺激所诱导的细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平增高(P＜0.05)以及细胞凋亡(P＜0.01)，但对TCA无显著影响(P＞0.05)。提示：复方中药可提供一定的肠道黏膜的保护作用，其对抗不同胆汁酸的保护作用以及机制有所差异。　　研究结论：　　本研究在前期动物在体实验的基础上进一步探讨复方中药抑制胆汁酸吸收及改善肠道上皮细胞屏障功能作用的机制，揭示了：1）复方中药可以有效抑制肠道上皮细胞对胆汁酸的吸收，该作用可能主要是通过下调ASBT和OSTβ基因mRNA及蛋白的表达来实现，其是复方中药抑制胆汁酸吸收的潜在作用靶点;2）复方中药能够显著对抗胆汁酸所引起的肠道屏障功能失调，上述保护作用可能主要是通过调节紧密连接蛋白Ocln和ZO2的表达以及抑制细胞内氧化应激水平和凋亡来实现。综上所述，复方中药可通过抑制胆汁酸在肠道的重吸收及维持肠道上皮细胞屏障功能，即祛除“腑中之痰浊”，从而发挥其降脂抗AS的作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 Caco-2细胞的培养及模型的建立与评价

一、实验设计

二、实验材料

三、实验方法

四、实验结果

五、分析与讨论

六、结论和意义

第二部分 复方中药抑制Caco-2细胞胆汁酸吸收的机制研究

一、实验设计

二、实验材料

三、实验方法

四、实验结果

五、分析与讨论

六、结论和意义

第三部分 复方中药保护肠道上皮细胞屏障功能的作用及机制研究

一、实验设计

二、实验材料

三、实验方法

四、实验结果

五、分析与讨论

六、结论和意义

附录

综述

参考文献

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