小胶质细胞CX3CR1通路在血管性认知障碍小鼠髓鞘修复中的机制研究

摘要

血管性认知功能障碍(Vascular Cognitive Impairment，VCI)是全球第二大常见的认知功能障碍，约占所有痴呆的20％，其中，脑白质损伤，即髓鞘或少突胶质细胞(Oligodendrocytes，OLs)损伤是VCI重要的病理改变。近年来中枢神经系统炎症细胞——小胶质细胞激活与白质损伤的关系备受关注。我们前期在VCI动物模型中发现，VCI小鼠髓鞘受损、小胶质细胞大量激活。同时，缺血引起小胶质细胞Fractalkine/CX3CR1通路激活、CX3CR1表达上调，其下游核转录因子κB-p50/65（Nuclear Factor-Kappa B，NF-κB）表达升高使小胶质细胞释放更多促炎因子，并导致认知功能障碍。因此我们提出通过调控CX3CR1相关信号通路调控小胶质细胞激活、减轻炎症反应，从而保护OLs、促进少突胶质细胞前体细胞(Oligodendrocyte Prescusor Cells，OPCs)成熟分化修复髓鞘并改善VCI认知功能。　　本课题采用双侧颈总动脉结扎(Bilateral Common Carotid Artery Occlusion，BCCAO)术构建VCI模型，分别对CX3CR1及其通路下游关键因子NF-κB与非受体型酪氨酸蛋白激酶Src进行拮抗。通过悬尾不动实验（Tail Suspension Test，TST）与强迫游泳实验（Forced Swimming Test，FST）观察药物抗抑郁作用;Morris水迷宫(Morris Water Maze，MWM)观察动物海马相关学习记忆功能改善情况。采用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测外周血清中炎症因子与髓鞘相关蛋白含量，坚牢蓝(Luxol Fast Blue，LFB)染色以及免疫组织化学染色标记髓鞘碱性蛋白(Myelin Basic Protein，MBP)分别观察胼胝体（Corpus Callosum，CC）与海马区髓鞘损伤与修复情况，免疫组织化学法标记离子钙接头蛋白抗原(Ionized Calcium Binding Adapter Molecule1，Iba-1)、神经胶质细胞抗原(Neuron-glial Antigen2，NG2)、O4与神经元核抗原(Neuronal Nuclei，Neun)观察海马激活小胶质细胞、OPCs、成熟前OLs与神经元数量。采用蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB）法对海马区MBP含量进行检测。　　第一部分研究表明，CX3CR1中和抗体anti-FKR干预后，VCI小鼠TST与FST不动时间明显缩短;MWM隐蔽站台实验第4天找到站台潜伏期时间明显缩短，空间探索实验穿越目标象限的次数、在目标象限停留的时间以及在目标象限游动的路程占总游动路程百分比均较VCI+NS组明显增加，提示拮抗CX3CR1明显改善VCI小鼠抑郁行为与海马相关学习记忆功能。CC区LFB与免疫组织化学MBP染色相应IOD值差异不具有统计学意义，而海马区免疫组化MBP染色以及WB分析MBP相应IOD值明显升高，外周血清MOG含量下降，提示拮抗CX3CR1能保护海马区髓鞘并促进髓鞘修复。拮抗CX3CR1后，海马区Iba-1阳性细胞数目明显减少，同时ELISA结果显示VCI+anti-FKR组IL-1β与TNF-α含量较VCI+NS组明显降低，表明拮抗CX3CR1能抑制小胶质细胞激活并减轻VCI小鼠炎症反应。此外，anti-FKR稍减少海马区NG2阳性细胞数并明显增加O4与Neun阳性细胞数，提示拮抗CX3CR1能促进海马区OPCs成熟分化、修复受损髓鞘，并保护神经元。　　第二部分研究表明，NF-κB拮抗剂PDTC干预后，VCI小鼠TST与FST不动时间明显缩短，而Src拮抗剂PP2上述作用并不明显。VCI+PDTC小鼠MWM隐蔽站台实验第4天找到站台潜伏期、空间探索实验游动速度、穿越平台次数、在平台象限停留时间、路程差异均不具有统计学意义，而VCI+PP2小鼠在隐蔽站台实验找到站台潜伏期时间明显缩短，空间探索实验穿越目标象限的次数与在目标象限游动的路程占总游动路程百分比均较VCI+NS组明显增加。拮抗NF-κB与Src蛋白后，CC区LFB与MBP染色相应IOD值比较结果显示差异均不具有统计学意义。使用PP2能明显增加海马区MBP免疫组织化学染色IOD值，并减少外周血中MOG含量，提示拮抗Src能保护海马区髓鞘并促进修复。与VCI+NS组相比，PDTC+NS组小鼠海马区Iba-1阳性细胞数明显减少，血清ELISA中IL-6、TNF-α、HMGB1含量明显降低，提示拮抗NF-κB能抑制内源性小胶质细胞激活并减轻炎症反应。与VCI+NS组相比，PP2+NS组小鼠海马区O4阳性细胞数明显增加、NG2阳性细胞数稍有减少而Iba-1与Neun阳性细胞数没有明显差异。提示拮抗Src能促进海马区OPCs成熟分化修复髓鞘。　　上述实验结果表明，CX3CR1中和抗体anti-FKR通过抑制CX3CR1通路能有效抑制VCI小鼠小胶质细胞激活并控制炎症反应、保护海马区神经元、促进海马区OPCs成熟分化并修复髓鞘，从而改善缺血小鼠认知功能障碍。NF-κB抑制剂PDTC能减少VCI动物在缺血缺氧时引起的小胶质细胞激活、缓解炎症，而Src抑制剂PP2能减少VCI小鼠缺血缺氧时髓鞘的损伤并促进OPCs成熟分化、髓鞘修复，从而分别改善VCI小鼠的抑郁与认知功能障碍。因此，调控CX3CR1下游的Src和/或NF-κB的作用可能是未来预防与治疗VCI潜在的重要靶点。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分CX3CR1受体对小胶质细胞调控和髓鞘修复的研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

第二部分CX3CR1调控小胶质细胞及髓鞘修复的分子机制

前言

材料和方法

实验结果

讨论

全文总结

参考文献

综述 痴呆相关白质病变

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢