积雪草酸诱导肝癌细胞凋亡及抑制其迁移侵袭的效应及机制研究

摘要

原发性肝癌(hepatocellular carcinoma)是一种常见的且发病率与病死率均较高的恶性肿瘤。虽然选择手术切除是肝癌患者的首选治疗方案，但是由于起病隐匿，导致很多患者在确诊后错过最佳诊治时间。除此之外局部治疗如TACE，PEI等，总体预后仍较差，副作用较多，疗效不尽如人意。然而目前中医药在改善患者生活质量，减轻患者病痛的方面具有较好的作用，并且在延长生存期方面具有巨大的潜在价值。积雪草酸(Asiatic acid，AA)又名亚细亚酸，存在于许多食用和药用植物中，大量临床研究表明积雪草酸具有抗癌潜力，基础研究表明积雪草酸可减轻炎症、抑制肿瘤细胞增殖、诱导线粒体凋亡等作用。据报道，积雪草酸能够抑制肝癌细胞的增殖促进凋亡，但能否抑制肝癌细胞的转移以及与增殖、凋亡、转移相关的具体机制还未见详细报道。本实验室长期从事研究中药以及中药单体对肝癌的治疗工作，具有较好的工作基础，本研究主要内容是探讨积雪草酸对于肝癌细胞增殖，凋亡以及侵袭的作用及其分子机制研究，为积雪草酸在肝癌的临床应用提供一定的理论依据。　　方法:1、运用CCK8和EdU试剂盒检测不同浓度的积雪草酸对于人肝癌细胞系Huh7、MHCC-97H增殖的影响。2、运用流式细胞术检测积雪草酸对于人肝癌细胞系Huh7、MHCC-97H细胞周期和凋亡的影响。3、运用transwell小室迁移实验来检测不同浓度（根据上述实验，选用对增殖凋亡影响较小的浓度）的积雪草酸对于高转移人肝癌细胞系MHCC-97H细胞迁移的影响，以及预制Matrige胶的transwell小室侵袭实验检测积雪草酸对于人肝癌细胞系MHCC-97H细胞侵袭的影响。4、运用western blot技术检测不同浓度的积雪草酸作用于人肝癌细胞系Huh7、MHCC-97H上对于MAPK和AKT信号通路上主要蛋白分子，相关凋亡的蛋白分子以及相关侵袭迁移蛋白分子的的影响，包括P-Akt，P-ERK1/2，P-P38，P-JNK，Akt，ERK1/2，P38，JNK;相关凋亡的蛋白分子包括cleaved-caspase3、cleaved-caspase9、bax、bcl-2、pro-caspase3、pro-caspase9;相关侵袭迁移的蛋白分子包括MMP-2、MMP-9。5、体内实验:将人肝癌细胞系Huh7植入小鼠皮下，成瘤后腹腔注射积雪草酸，观察积雪草酸对于裸鼠皮下瘤的抑制作用以及检测裸鼠的肝肾生化功能验证其安全性。　　第一部分:积雪草酸对于肝癌细胞增殖、凋亡的影响　　目的:探究积雪草酸对于肝癌细胞增殖、凋亡的作用及其相关机制　　方法:1、运用CCK8和EdU试剂盒检测不同浓度的积雪草酸对于人肝癌细胞系Huh7增殖的影响。4、运用流式细胞术检测积雪革酸对于人肝癌细胞系Huh7细胞周期和凋亡的影响。3、运用western blot技术检测不同浓度的积雪草酸作用于人肝癌细胞系Huh7上对于MAPK和AKT信号通路上主要蛋白分子以及相关凋亡的蛋白分子的影响，包括P-Akt，P-ERK1/2，P-P38，Akt，ERK1/2，P38;相关凋亡的蛋白分子包括cleaved-caspase3、cleaved-caspase9、bax、bcl-2、pro-caspase3、pro-caspase9。4、体内实验:将人肝癌细胞系Huh7植入小鼠皮下，成瘤后腹腔注射积雪草酸，观察积雪草酸对于裸鼠皮下瘤的抑制作用以及检测裸鼠的肝肾生化功能验证其安全性。　　结果:1、CCK8实验结果显示，随着时间和药物浓度的增加，积雪草酸对于人肝癌细胞系Huh7细胞活性有明显抑制，且在浓度为50μM、100μM时作用效果较强;而对正常人肝细胞LO2无较大影响，仅当积雪草酸浓度在100μM，且作用了24h后有轻微的抑制作用;EdU结果显示，随着积雪草酸浓度的增加，对人肝癌细胞系Huh7的增殖有明显的抑制作用，呈剂量依赖性。当浓度为100μM，可抑制80.37±2.34％的细胞增殖。2、流式细胞术检测细胞周期结果显示积雪草酸以剂量依赖性方式诱导人肝癌细胞Huh7在G1期细胞的积聚和G2/M期细胞的减少，表明积雪草酸抑制细胞从G1向G2/M期的转化;检测细胞凋亡显示人肝癌细胞系Huh7凋亡率随着积雪草酸浓度的升高而升高，具有浓度依赖性。3、western blot实验结果显示，随着积雪草酸的剂量增加，人肝癌细胞系Huh7上cleaved-caspase3和cleaved-caspase9的蛋白质水平而提高，pro-caspase3和pro-caspase9的蛋白质水平水平几乎没有变化。此外，bax的表达水平以剂量依赖性方式增加，而bcl-2表达减少。P-Akt的水平在100μM时显着降低，P-ERK1/2水平以剂量依赖性方式显著降低，P-P38的表达在10μM或更高浓度时显著增加。Akt，ERK1/2和P38的水平基本保持不变。4、体内实验结果表明积雪草酸组可以较好的抑制皮下瘤的生长，免疫组化结果显示，随着积雪草酸浓度的升高，增殖标记物ki-67水平被抑制，凋亡标记物bcl-2水平被抑制，bax水平升高，表明积雪草酸可以有效的抑制裸鼠皮下瘤肿瘤细胞的增殖，促使凋亡。　　结论:积雪草酸可以抑制人肝癌细胞Huh7增殖，且促进其凋亡。分子机制与调节相关凋亡蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9、bax、bcl-2的表达，以及调节MAPK和AKT信号通路相关。并且积雪草酸在裸鼠体内可以抑制皮下瘤生长，具有安全性。　　第二部分:积雪草酸对于肝癌细胞迁移、侵袭的影响　　目的:探究积雪草酸对于肝癌细胞迁移、侵袭的作用及其相关机制　　方法:1、完善积雪草酸对于肝癌细胞的作用，同时也检测积雪草酸对人肝癌细胞系MHCC-97H细胞增殖与凋亡的影响，运用CCK8检测不同浓度的积雪草酸对于人肝癌细胞系MHCC-97H增殖的影响。2、运用流式细胞术检测积雪草酸对于人肝癌细胞系MHCC-97H凋亡的影响。3、运用transwell小室迁移实验来检测不同浓度（选用对增殖凋亡影响较小的浓度）的积雪草酸对于高转移人肝癌细胞系MHCC-97H细胞迁移的影响，以及预制Matrige胶的transwell小室侵袭实验检测积雪草酸对于人肝癌细胞系MHCC-97H细胞侵袭的影响。4、运用western blot技术检测不同浓度的积雪草酸作用于人肝癌细胞系MHCC-97H上对于MAPK信号通路上主要蛋白分子以及相关侵袭迁移的蛋白分子的影响，MAPK信号通路上关键分子蛋白包括P-ERK1/2、P-P38、P-JNK、ERK1/2、P38、JNK;相关侵袭迁移的蛋白分子包括MMP-2、MMP-9。　　结果:1、CCK8实验结果显示，随着时间和药物浓度的增加，积雪草酸对于人肝癌细胞系MHCC-97H细胞活性有明显抑制。2、流式细胞术检测细胞凋亡显示人肝癌细胞系MHCC-97H细胞凋亡率随着积雪草酸浓度的升高而升高，具有浓度依赖性。3、Transwell小室实验结果显示当浓度大于10μM时，能够较有效的抑制人肝癌细胞系MHCC-97H迁移和侵袭。4、western blot实验结果显示，积雪草酸作用在人肝癌细胞系MHCC-97H24h后，MMP-2和MMP-9的蛋白质水平随着积雪草酸的剂量降低，MMP-9的水平在10μM之后变化较小。P-ERK1/2水平以剂量依赖性方式降低，P-P38的表达在25μM浓度时显著增加。P-JNK的表达在25μM浓度时显著抑制，其他浓度上变化不显著。ERK1/2，P38和JNK的水平基本保持不变。　　结论:积雪草酸可以抑制人肝癌细胞MHCC-97H侵袭和迁移，分子机制与调节MMP-2、MMP-9的表达，以及调节MAPK信号通路相关。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

参考文献

第一部分积雪草酸对于人肝癌细胞Huh7增殖、凋亡影响的体内外研究

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

第二部分积雪草酸对人肝癌细胞MHCC-97H迁移、侵袭的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

全文小结

综述

科研工作简介

致谢