CRISPLD2蛋白在脂多糖诱导急性呼吸窘迫综合征中的作用及临床价值探讨

摘要

感染，特别是严重感染，依然是临床危重病患者诊治过程中的关键和困难之处。控制不佳的严重感染会诱发感染性休克、多脏器功能障碍等等一系列严重并发症，甚至导致患者死亡。急性呼吸窘迫综合征(ARDS)多由各种感染、多发伤、严重创伤、大剂量输血等情况诱发，其中感染是最主要的原发病。肺内感染以及肺外组织感染均可诱发ARDS。多数ARDS患者起病突然，病程进展迅速，危及生命健康。革兰氏阴性菌(G-)、革兰氏阳性菌(G+)、真菌、支原体、病毒等等各类致病微生物均可通过引发全身炎症反应或肺组织局部炎症反应而诱发ARDS。G-菌是临床感染中最常见、最主要的致病菌，通过细菌膜上的脂多糖(LPS)成分与人体细胞(特别是免疫细胞)膜上的Toll样受体4(TLR4)以及MD蛋白结合启动机体的炎症反应。当感染程度较重、炎症反应失控时，患者即表现出肺组织受损、ARDS的临床症状。迄今为止，尚未有针对ARDS治疗的特效药物/疗法，ARDS死亡率仍然居高不下。ARDS的诊治方式仍以“控制原发感染、维持体内液体平衡与改善液体分布、呼吸机支持”为主，通过动脉血气分析、肺部影像学、PCT、血常规等检测项目评估病情。　　CRISPLD2蛋白初期被科研人员用以研究肺、肾脏以及面部结构形态发育；2009年王志勤等人提出该蛋白除以上功能外，还可通过自身具有的2个LCCL结构域高亲和力地结合LPS；在此基础上有人提出CRISPLD2蛋白影响机体器官发育过程可能也与其能够结合 LPS、抑制炎症反应相关。因此我们设想 CRISPLD2 蛋白能否应用于LPS 所诱发 ARDS 患者的临床诊疗和评估。我们拟通过体外细胞实验、动物实验以及临床患者观察性研究进一步明确CRISPLD2蛋白在LPS-ARDS患者中的价值。　　第一部分 重组crispld2蛋白对脂多糖体外诱导小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞及人外周血单个核细胞分泌促炎性因子的影响　　目的：观察不同浓度脂多糖(LPS)是否能够影响小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞及人外周血单个核细胞分泌crispld2／CRISPLD2蛋白；观察重组crispld2蛋白能否降低脂多糖体外诱导的小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞及人外周血单个核细胞分泌促炎性因子浓度的下降。　　方法：原代培养小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞；取部分Ⅱ型上皮细胞分为空白对照组、脂多糖(1 μg／ml)组进行实验，每组细胞板平行12孔，分别于第0小时、第6小时、第12小时各取4孔细胞上清液通过酶联免疫吸附法测定上清液中crispld2蛋白浓度；取部分Ⅱ型上皮分为空白对照组、脂多糖(1 μg／ml)组、脂多糖(1 μg／ml)+重组crispld2蛋白(5 μg)组进行实验，每组细胞板平行12孔，分别于第0小时、第6小时、第12小时各取4孔细胞上清液通过酶联免疫吸附法测定上清液中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6浓度。体外培养健康人外周血单个核细胞，取部分单个核细胞分为空白对照组、LPS（0.1 μg／ml)组、LPS（1 μg／ml)组进行实验，每组细胞板平行12孔，分别于第0小时、第6小时、第12小时各取4孔细胞上清液通过酶联免疫吸附法测定上清液中CRISPLD2蛋白浓度；取部分单个核细胞分为脂多糖(10 ng／ml)组、脂多糖(10 ng／ml)+重组CRISPLD2蛋白(0.5 μg)组、脂多糖(10 ng／ml)+重组CRISPLD2蛋白(5 μg)组及脂多糖(10 ng／ml)+anti-CRISPLD2蛋白(100 μg／ml)组进行实验，每组细胞板平行8孔，分别于第6小时、第12小时各取4孔细胞上清液通过酶联免疫吸附法测定上清液中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6浓度。　　结果：在小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞实验中，脂多糖能够显著提升细胞上清液中crispld2蛋白的浓度，在第6小时、第12小时均有明显统计学差异；脂多糖组、脂多糖+重组crispld2蛋白组细胞上清液中分泌的肿瘤坏死因子α、白细胞介素6浓度与空白对照组相比均明显增加，脂多糖+重组crispld2蛋白组促炎性介质升高更加显著，三组间在第6小时、第12小时进行对比均有明显统计学差异；在人外周血单个核细胞实验中， LPS（0.1 μg／ml)组、LPS（1 μg／ml)组较空白对照组均能明显提高细胞上清液中的CRISPLD2蛋白分泌浓度，LPS（1 μg／ml)组更加明显，三组间比较在第0小时、第6小时、第12小时各个时间点均有明显统计学差异；脂多糖(10 ng／ml)+重组CRISPLD2蛋白(0.5 μg)组、脂多糖(10 ng／ml)+重组CRISPLD2蛋白(5 μg)组与脂多糖(10 ng／ml)组相比较能够降低细胞上清液中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6浓度，并且重组CRISPLD2蛋白(5 μg)组降低的更加明显，三组在第6小时、第12小时比较均有明显统计学意义；脂多糖(10 ng／ml)+anti-CRISPLD2蛋白(100 μg／ml)组与脂多糖(10 ng／ml)组相比较，细胞上清液中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6浓度升高更加明显，在第6小时、第12小时均有明显统计学差异。　　结论：LPS可刺激小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞及人外周血单个核细胞分泌crispld2蛋白，在一定范围内呈现正相关的量效关系；重组crispld2／CRISPLD2蛋白能够降低LPS刺激所引起的小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞及人外周血单个核细胞分泌促炎性介质的浓度，此作用强度与重组crispld2／CRISPLD2蛋白的使用剂量正相关；加入anti-CRISPLD2蛋白可提升LPS刺激人外周血单个核细胞对促炎性介质的表达；说明CRISPLD2蛋白可降低LPS所诱导的炎症因子表达水平，减轻炎症反应。　　第二部分 重组crispld2蛋白对脂多糖-诱导急性呼吸窘迫综合征小鼠促炎性因子表达影响的量效与时效关系　　目的：探讨重组crispld2蛋白对脂多糖-诱导急性呼吸窘迫综合征小鼠肺泡灌洗液及血中促炎性因子表达的影响，明确是否存在确切的量效关系与时效关系，确定重组crispld2蛋白对脂多糖诱导急性呼吸窘迫综合征小鼠的保护作用。　　方法：1.将健康雄性昆明小鼠随机分5组：模型对照组，将脂多糖按5mg/kg滴入组内小鼠气道内，制成脂多糖诱导急性呼吸窘迫综合征模型对照组；高剂量重组crispld2蛋白预处理组，按照5mg/kg剂量先给予昆明小鼠尾静脉注射重组crispld2蛋白，在注射后第6小时将脂多糖按5mg/kg滴入组内小鼠气道内；低剂量重组crispld2蛋白预处理组，按照2mg/kg剂量先给予昆明小鼠尾静脉注射重组crispld2蛋白，在注射后第6小时将脂多糖按5mg/kg滴入组内小鼠气道内；高剂量重组crispld2蛋白后处理组，将脂多糖按5mg/kg滴入组内小鼠气道内，在第6小时按照5mg/kg剂量给予昆明小鼠尾静脉注射重组crispld2蛋白；低剂量重组crispld2蛋白后处理组，将脂多糖按5mg/kg滴入组内小鼠气道内，在第6小时按照2mg/kg剂量给予昆明小鼠尾静脉注射重组crispld2蛋白。所有小鼠在脂多糖气道滴入后第12小时测动脉血气、留取血标本并处死；收集支气管肺泡灌洗液，离心后计数沉淀中性粒细胞，测量上清液中的肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β及白细胞介素-6浓度；测量血标本中的肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β及白细胞介素-6浓度；观察小鼠肺组织病理形态学变化，测定肺湿干重比(W/D)、通透指数(LPI)。2.将健康的雄性昆明小鼠随机分为3组：模型对照组，将脂多糖按5mg/kg滴入组内小鼠气道内，制成脂多糖诱导急性呼吸窘迫综合征模型对照组；脂多糖预处理组：将脂多糖按2mg/kg予小鼠腹腔内注射，注射后第8天气道内滴入5mg/kg剂量的脂多糖；重组crispld2蛋白预处理组：将重组crispld2按5mg/kg剂量予小鼠尾静脉注射，注射后第6小时将脂多糖按5mg/kg滴入小鼠气道。观察5d内三组内小鼠死亡情况，描绘生存曲线。　　结果：1.高剂量重组crispld2蛋白预处理组、低剂量重组crispld2蛋白预处理组肺泡灌洗液中的中性粒细胞计数、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6以及血标本肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β及白细胞介素-6检测值均明显低于模型对照组、高剂量重组crispld2蛋后处理组、低剂量重组crispld2蛋后处理组(P＜0.05)，高剂量重组crispld2蛋白预处理组以上检测值均明显低于低剂量重组crispld2蛋白预处理组(P＜0.05)；高剂量重组crispld2蛋白预处理组、低剂量重组crispld2蛋白预处理组动脉血氧含量高于模型对照组、高剂量重组crispld2蛋后处理组、低剂量重组crispld2蛋后处理组(P＜0.05)，肺干湿比与肺血管通透指数显著低于模型对照组、高剂量重组crispld2蛋后处理组、低剂量重组crispld2蛋后处理组(P＜0.05)；高剂量重组crispld2蛋白预处理组动脉血氧含量高于低剂量重组crispld2蛋白预处理组，其余检测结果低于低剂量重组crispld2蛋白预处理组(P＜0.05)；模型对照组、高剂量重组crispld2蛋后处理组、低剂量重组crispld2蛋后处理组间各项检测值无统计学差异(P＞0.05)。2. 脂多糖预处理组、重组crispld2蛋白预处理组两组肺干湿比、肺血管通透指数及5天死亡率显著低于模型对照组(P＜0.05)；脂多糖预处理组各项检测结果低于重组crispld2蛋白预处理组(P＞0.05)。　　结论：重组crispld2蛋白可下调脂多糖所诱导急性呼吸窘迫综合征小鼠肺泡灌洗液及血中的炎症因子表达水平，并且呈现一定的剂量依赖关系。未发现小鼠造模成功后给予的重组crispld2蛋白对模型小鼠的保护作用。提升crispld2蛋白血浓度对脂多糖所致急性呼吸窘迫综合征小鼠具有保护作用，可降低肺损伤程度，改善肺毛细血管通透性，降低死亡率。　　第三部分 CRISPLD2蛋白在肺内革兰氏阴性细菌感染所致急性呼吸窘迫综合征患者中的表达及其病情的评估价值　　目的：观察CRISPLD2蛋白在肺部革兰氏阴性细菌感染所诱发的急性呼吸窘迫综合征患者血清及肺泡灌洗液中的表达情况；观察CRISPLD2蛋白与患者病情严重程度间的关系。　　方法：共收集上海长征医院急救科监护病房2013年1月至2016年4月期间收治的符合入组条件的急性呼吸窘迫综合征患者33例，其中男性15例，女性18例，入院后计算急性生理与慢性健康Ⅱ评分，24小时内送检深部气道痰标本，抽取动脉血行血气分析检查并计算氧合指数，留取血标本检测CRISPLD2蛋白浓度、降钙素原、内毒素，留取肺泡灌洗液检测CRISPLD2蛋白浓度。按性别(男，女)、年龄(≤35岁，＞35岁)、病情轻重(氧合指数≤100，＞100)分组，观察血清及肺泡灌洗液CRISPLD2蛋白、降钙素原、内毒素、急性生理与慢性健康Ⅱ评分有组间无差别；分析血清CRISPLD2蛋白浓度、肺泡灌洗液CRISPLD2蛋白浓度与降钙素原、内毒素、急性生理与慢性健康Ⅱ评分的线性关系；依据观察入组患者28天死亡情况，分析血清CRISPLD2蛋白浓度、肺泡灌洗液CRISPLD2蛋白浓度与患者死亡情况的关系。　　结果：1.按性别(男，女)、年龄(≤35岁，＞35岁)分组，血清及肺泡CRISPLD2蛋白、降钙素原、内毒素、急性生理与慢性健康Ⅱ评分组间差异无统计学意义；按病情轻重(氧合指数≤100，＞100)分组，血清CRISPLD2蛋白(124.09±24.25、177.61±15.30)、肺泡灌洗液CRISPLD2蛋白(49.97±17.23、74.14±15.3)、降钙素原(7.95±3.20、3.42±1.50)、内毒素(0.93±0.24、0.54±0.16)、急性生理与慢性健康Ⅱ评分(12.32±2.65、8.50±1.61)组间差异均有统计学意义。2. 血清CRISPLD2蛋白与降钙素原、内毒素、急性生理与慢性健康Ⅱ评分、氧合指数有线性关系，r值分别为-0.883、-0.822、-0.706、0.952；肺泡灌洗液CRISPLD2蛋白与降钙素原、内毒素、急性生理与慢性健康Ⅱ评分、氧合指数有线性关系，r值分别为-0.809、-0.709、-0.605、0.781。3. 血清CRISPLD2蛋白、肺泡灌洗液CRISPLD2蛋白与患者死亡情况均无线性关系，同时无法准确预测患者预后。　　结论：血清及肺泡灌洗液CRISPLD2蛋白浓度与患者病情严重程度密切相关，与临床常用评估标准吻合，但不能准确判断患者预后情况。

目录

英文缩略和专用词表

第一部分 重组crispld2蛋白对脂多糖体外诱导小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞及人外周血单个核细胞分泌促炎性因子的影响

一、引言

二、实验材料与方法

（一）试剂与仪器

（二）小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的培养

（三）人PBMC细胞的培养

（四）重组CRISPLD2蛋白／crispld2蛋白的制备

（五）实验分组及实施方法

（六）统计分析

三、实验结果

1.重组crispld2蛋白抑制脂多糖所诱导的小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞对肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6的表达

2. 重组CRISPLD2蛋白抑制脂多糖诱导人外周血单个核细胞表达肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6

3. 脂多糖上调小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞表达crispld2蛋白，不同浓度脂多糖对人外周血单个核细胞表达CRISPLD2蛋白的影响

四、讨论

五、结论

参考文献

第二部分 重组crispld2蛋白对脂多糖-诱导急性呼吸窘迫综合征小鼠促炎性因子表达影响的量效与时效关系

一、引言

（一）试剂与仪器

（二）重组crispld2蛋白制备

（三）气道滴入LPS制备ARDS小鼠模型

（四）小鼠支气管肺泡灌洗液收集

（五）小鼠肺干湿比测量

（六）小鼠肺血管通透性指数

（七）小鼠肺病理切片制备

（八）实验分组及实施方法

（九）统计分析

三、实验结果

1.重组 crispld2 蛋白对脂多糖-急性呼吸窘迫综合征小鼠肺泡灌洗液中的中性粒细胞计数影响

2.重组crispld2蛋白对脂多糖-急性呼吸窘迫综合征小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β及IL-6的影响

3.重组crispld2蛋白对脂多糖-急性呼吸窘迫综合征小鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-6表达的影响

4.重组crispld2蛋白对脂多糖-急性呼吸窘迫综合征小鼠RR与动脉PaO2的影响

4. 重组crispld2蛋白对脂多糖-急性呼吸窘迫综合征小鼠W/D、LPI的影响

5.肺组织病理形态学观察和肺损伤评分

6.实验小鼠5天生存率

四、讨论

五、结论

参考文献

第三部分 CRISPLD2蛋白在肺内革兰氏阴性细菌感染所致急性呼吸窘迫综合征患者中的表达及其病情的评估价值

一、引言

二、实验对象与方法

（一）病例收集：

（二）临床病例观察指标的采集

（三）标本检测

（四）分组方法

（五）统计方法

三、结果

1.临床患者一般资料

2.按性别、年龄、氧合指数分层分析

3.血清/肺泡灌洗液CRISPLD2蛋白浓度与PCT、脂多糖、APACHEⅡ评分以及氧合指数的线性关系

4.CRISPLD2蛋白与患者死亡情况的关系

四、讨论

五、结论

参考文献

综述一:体外膜肺氧合技术在急性呼吸窘迫综合征中的应用

综述二:急性呼吸窘迫综合征的吸入治疗

博士在读期间发表的论文及参与的科研项目

致谢