自噬在气泡损伤血管内皮细胞中的作用及机制

摘要

随着我国宏观经济的飞速发展，海洋战略持续推进，商业、军事以及休闲潜水迅猛发展。水下高气压环境下，人体内会溶解生理性惰性气体，上浮过程中若减压不当，这部分气体会在组织或血管内形成气泡，通过机械作用和生化效应导致减压病(DCS)。DCS发病迅速，症状复杂，救治困难，后果严重，其防治是确保潜水安全的关键。深入阐明DCS发病机制，是寻找有效防治措施的基础。　　血管内皮细胞(VEC)广泛参与血管舒缩功能、凝血、免疫及炎症反应的调节，对维持内环境稳态具有重要作用。DCS患者常存在外周血管僵硬度升高和血液内皮标志物水平变化，提示VEC损伤。课题组前期研究发现，内皮保护剂迈之灵和辛伐他汀在缓解VEC损伤及继发炎性反应的同时，显著改善大鼠DCS发病情况;进一步研究证实，气泡是DCS中VEC损伤的触发因素，其继发的生化效应可进一步加剧VEC损伤。这些结果提示，气泡所致VEC损伤及其继发效应是DCS病理生理进程中的关键环节。然而，气泡损伤VEC的具体机制尚未明确。　　自噬是将胞内衰老或受损的细胞器及生物大分子等成分包裹在特定的双层膜结构中，运输到溶酶体降解再利用的过程，几乎发生于所有哺乳动物细胞。自噬广泛参与VEC生理病理活动，保护或促进细胞损伤。VEC自噬可被血流剪切力及Ca2+等多种因素激活。血管内气泡随血液流动，可改变血流剪切力;包括本课题组在内的多项研究表明气泡可导致VEC内Ca2+升高。因此，我们推测自噬很可能参与气泡损伤VEC进程。本研究拟以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为研究对象，建立细胞层-多气泡触碰装置，系统研究气泡对VEC自噬的影响及其规律，明确自噬在气泡损伤VEC中的作用并初步阐明其机制，为探索有效的DCS防治措施提供理论依据。　　第一部分 自噬在气泡损伤血管内皮细胞中的作用　　一、气泡对VEC自噬的影响及其规律　　研究方法:建立细胞层-多气泡触碰装置，给予HUVEC不同时间的气泡触碰后，检测自噬标志蛋白变化，分析其同气泡触碰时间的相关性。　　研究结果:气泡触碰30min后，HUVEC内LC3-Ⅱ/Ⅰ比值及Beclin-1蛋白在气泡触碰后2h开始升高，8h达到峰值，24h后仍高于正常对照;P62蛋白在气泡触碰后4h开始下降，8h降至最低，24h仍低于正常对照。选择气泡处理结束后8h作为自噬蛋白的检测时间点。气泡触碰30min后8h于电镜下观察到HUVEC内自噬小体的数量增加。同正常对照相比，气泡触碰1、5、10、20、30min后，HUVEC内LC3-Ⅱ/Ⅰ比值及Beclin-1蛋白水平逐渐升高，其程度同气泡触碰时间正相关;P62蛋白水平逐渐降低，其程度同气泡触碰时间负相关。因LC3-Ⅱ/Ⅰ比值同气泡触碰时间的相关系数最大，选择其作为本研究中自噬活性程度指标。　　研究结论:气泡触碰可激活VEC自噬，其水平同气泡触碰时间密切相关。LC3-Ⅱ/Ⅰ比值可作为自噬活性程度指标。　　二、自噬在气泡损伤VEC中的作用　　研究方法:给予HUVEC上述方案的气泡触碰，检测细胞损伤相关指标，并分析其同LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的相关性。以自噬抑制剂3-甲基嘌呤(3-MA)预处理细胞后，再给予气泡触碰，检测各损伤指标的变化。　　研究结果:同正常对照组相比，在气泡触碰10、20、30min组，细胞活力明显下降，细胞凋亡率、促凋亡蛋白cytochromeC及cleaved caspase-3水平显著升高，而在气泡触碰1、5min后未检测到明显改变。相关性分析显示各损伤指标同LC3-Ⅱ/Ⅰ比值密切相关。在3-MA预处理下，可增加气泡触碰10、20、30min组的细胞活力，同时降低细胞凋亡率、cytochromeC及cleaved caspase-3蛋白水平;对于气泡触碰1或5min，联合使用3-MA导致细胞活力下降，细胞凋亡率、cytochrome C及cleaved caspas-3蛋白水平升高。提示短时间（1、5min）的气泡触碰激活自噬，可保护VEC免受损伤，而长时间(10、20、30min)气泡触碰诱导的自噬，又可促进VEC损伤。　　根据上述结果，我们探索了气泡预处理激活自噬对后续VEC损伤的影响。依据VEC损伤程度同气泡触碰时间的关系，筛选气泡处理1min和30min分别代表轻重两种强度的刺激，以VEC内自噬激活峰值时间点，即8h作为两次气泡触碰间隔时间。因上述细胞损伤指标变化程度均同气泡触碰时间明显相关，故选取细胞活力和细胞凋亡率作为本研究评估细胞损伤程度的指标。结果显示，同单次气泡触碰30min相比，1min+30min(气泡触碰1min，隔8h后再次触碰30min)组的细胞活力明显增加，细胞凋亡率显著降低，该差异被3-MA抑制;而30min+30min(气泡触碰30min，隔8h后再次触碰30min)组的细胞活力进一步降低，细胞凋亡率明显增加，而在3-MA作用下出现相反变化。　　研究结论:自噬在气泡损伤VEC进程中发挥双向作用，短时间(1、5min)气泡触碰通过适度激活VEC自噬，发挥保护作用，但随着气泡触碰时间的延长(10、20、30min)，进一步加大自噬激活程度，促进VEC损伤。　　第二部分 气泡诱导血管内皮细胞自噬的机制　　研究方法:采用细胞层-多气泡触碰装置，给予HUVEC不同时间的气泡触碰，检测胞内Ca2+、活性氧(ROS)及自噬激活重要通路分子的变化及其规律，通过使用钙螯合剂邻氨基苯氧乙醇四乙酸(BAPTA)、抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)、通路特异性抑制剂或激动剂，检测各分子在气泡激活VEC自噬中的作用及相互关系。　　研究结果:与正常对照组相比，在气泡触碰1、5、10、20、30min组，HUVEC内Ca2+增加，其程度同气泡触碰时间及胞内LC3-Ⅱ/Ⅰ比值正相关，BAPTA可明显降低各组LC3-Ⅱ/Ⅰ比值。气泡触碰10、20、30min后，HUVEC内ROS显著增加，而在1或5min组未检测到明显变化。分别以BAPTA和NAC预处理HUVEC后再次气泡触碰30min，发现BAPTA可显著抑制胞内ROS的增加，NAC对胞内Ca2+水平无明显改变，但明显降低LC3-Ⅱ/Ⅰ比值。　　进一步发现气泡触碰30min可激活胞内钙调素依赖蛋白激酶的激酶-β(CaMKK-β)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)，同时抑制蛋白激酶B（AKT）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)。除ERK抑制剂PD98059外，CaMKK-β抑制剂STO-609、AMPK抑制剂Compound C与AKT激动剂SC79均可显著上调气泡触碰30min组的mTOR活性，降低LC3-Ⅱ/Ⅰ比值。在气泡触碰1或5min后，仅检测到CaMKK-β和AMPK被激活，而10、20、30min的气泡触碰除了激活CaMKK-β和AMPK，同时抑制AKT和mTOR。　　最后证实BAPTA预处理下再次气泡触碰30min，HUVEC内CaMKK-β和AMPK活性下调，同时上调AKT和mTOR;NAC也可部分抑制气泡触碰30min激活的AMPK，并上调AKT和mTOR，但对CaMKK-β无明显影响。　　研究结论:短时间(1、5min)气泡触碰可通过增加胞内Ca2+，继而经CaMKK-β/AMPK通路激活VEC自噬;随着气泡触碰时间的延长(10、20、30min)，胞内Ca2+继续增加，除激活CaMKK-β/AMPK通路外，还可通过诱导ROS增多，进一步激活AMPK并抑制AKT，经mTOR激活自噬。

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摘要

缩略词表

第一部分:自噬在气泡损伤血管内皮细胞中的作用

前言

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

第二部分:气泡诱导血管内皮细胞自噬的机制

前言

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

全文总结

参考文献

综述:血管内皮细胞与自噬的研究进展

在读期间论文发表和科研工作情况说明

致谢