1、H2S对血氧饱和度和红细胞携氧能力的调节作用；2、胎盘中CBS在宫内生长受限中作用的研究

摘要

本论文分为两部分，第一部分主要探究H2S对血氧饱和度及血红蛋白携氧能力的调控。第二部分主要探究胎盘中H2S生成酶CBS对宫内生长受限的影响及相关机制。　　第一部分　　H2S是近年来热门研究的三大气体递质之一，涉及到多种生理、病理生理进程。其中，在缺氧过程中，H2S发挥了重要功能，包括介导颈动脉体对氧气浓度变化的感知，保护缺氧诱导的细胞凋亡、组织损伤等。硫巯基化是H2S一种蛋白转录后修饰方式，影响蛋白的功能和稳定性，介导了H2S众多生理功能，　　之前有文献报道，缺氧条件下红细胞及血液循环中H2S水平降低。在本研究中，也发现，小鼠缺氧后H2S水平降低，同时给与H2S供体GYY4137能够缓解缺氧诱导的组织缺氧。并且在Cse-/-小鼠中，H2S水平降低，同时动脉血氧饱和度降低，组织缺氧，GYY4137治疗后都有所缓解。进一步研究表明，H2S能够提高肺部换气功能，增加血氧饱和度，缓解组织缺氧。　　在之前的研究中证实Cse基因敲除小鼠红细胞中2，3-BPG含量显著增加，P50增加，血红蛋白与氧气结合能力减弱。同时H2S供体GYY4137能够恢复红细胞中2，3-BPG水平，降低P50。并且，GYY4137能够直接降低离体培养的红细胞中2，3-BPG的水平，降低P50。在本研究中，也发现，H2S能够降低缺氧诱导的2，3-BPG生成，并且H2S能够直接降低缺氧条件下离体培养的红细胞2，3-BPG的生成。接下来探究了H2S调控2，3-BPG生成的分子机制。证实，H2S通过硫巯基化血红蛋白，抑制了BPGM释放到包浆，调控了红细胞中2，3-BPG的生成。　　主要实验结果如下:　　一、H2S缓解了缺氧诱导的组织缺氧　　1.缺氧条件下，H2S生成减少　　2.H2S缓解了缺氧诱导的组织缺氧　　(1)缺氧条件下SaO2降低，同时GYY4137能够增加缺氧下的SaO2。(2)与常氧小鼠组织相比，缺氧组织中缺氧探针染色信号明显增强，同时GYY4137处理缓解了组织缺氧。　　3.缺氧条件下，外周组织及红细胞中CSE表达降低而CBS没有显著变化　　二、H2S缓解了Cse-/-小鼠组织缺氧　　为了探究H2S在组织缺氧中的作用，构建了Cse基因敲除小鼠。与WT小鼠相比，Cse-/-小鼠血液循环中H2S水平降低，同时动脉血氧饱和度降低，组织缺氧。同时GYY4137治疗缓解了Cse-/-小鼠组织缺氧。　　三、H2S减少损伤了肺部结构功能，降低了动脉血氧饱和度　　接下来进一步探究H2S调控血氧饱和度的机制。　　1.Cse-/-小鼠肺部血流灌注没有变化，而GYY4137显著增加了肺部血流　　2.GYY4137不能通过增加肺部血流灌注提高Cse-/-小鼠SaO2，改善组织缺氧　　吡那地尔能显著降低Cse-/-小鼠血压，增加肺部血流灌注，但是吡那地尔处理后并不能提高Cse-/-小鼠SaO2，也不能改善组织缺氧。　　四、外周来源的H2S调控了红细胞中2，3-BPG生成，影响红细胞携氧　　1.H2S调控2，3-BPG生成，影响红细胞携氧能力　　先前的研究表明，在Cse基因敲除的转基因小鼠中，红细胞中的2，3-BPG显著增高，P50增加，GYY4137降低了Cse-/-红细胞的2，3-BPG及P50。同时GYY4137也能够直接调控离体培养的小鼠和人的红细胞的2，3-BPG及P50。接下来在缺氧动物模型中发现:(1)与常氧小鼠相比，GYY4137能够降低缺氧诱导的2，3-BPG及P50的增加。(2)离体培养的小鼠红细胞，GYY4137能够降低缺氧诱导的红细胞中2，3-BPG的生成。　　2.外周来源的H2S调控了红细胞中2，3-BPG　　结论：　　常氧条件下，体内H2S水平正常，从而保护了肺部换气功能，维持红细胞中2，3-BPG在正常水平。缺氧条件下，体内H2S水平减少，影响肺换气，降低血氧饱和度;同时H2S水平减少促进红细胞中2，3-BPG的生成，促进红细胞氧气在外周组织的释放，缓解组织缺氧。　　第二部分　　宫内生长受限（Intrauterine Growth Restriction,IUGR）是常见的妊娠期并发症，在全世界发病率约为3％-8％。宫内生长受限是指胎儿在妊娠期未能达到其遗传学的生长能力，造成胎儿体重减小，发育异常。宫内生长受限是由一系列潜在因素导致的复杂的多因素紊乱。目前的研究表明，宫内生长受限最重要的原因为胎盘功能异常。胎盘是妊娠期胎儿唯一的胎外器官，为胎儿的生长提供了必须的营养物质及氧气，同时能够分泌激素维持妊娠过程，产生免疫耐受的宫内环境。胎盘功能异常包括胎盘血管发育异常，血流灌注减少，迷路中交换面积减少以及胎盘中营养物质运输功能损伤，最终导致胎儿宫内生长发育过程中不能获得足够的营养物质及氧气，导致宫内生长受限。　　H2S是继NO、CO后发现的人体内第三个气体递质。目前的研究表明H2S参与了多种生理学及病理生理学过程，例如血管舒张、炎症、血管发生、细胞凋亡及氧化应激等。近年来发现H2S对妊娠期间胎儿生长发育起到了重要的生理功能。为了探究H2S及其生成酶在妊娠期间胎盘结构功能的作用，首先利用遗传学技术获得了胎盘CBS特异性敲低的转基因老鼠，发现，在妊娠期间，并没有出现子痫前期的临床表型，而是出现了胎儿宫内生长受限的临床表型，并且给与H2S供体后能够缓解，这说明CBS敲低导致的H2S水平降低会影响胎盘的结构功能，从而导致胎儿宫内生长发育异常。　　主要实验结果如下:　　一、胎盘特异性CBS敲低导致IUGR。　　1.胎盘特异性CBS敲低小鼠的妊娠结局　　利用转基因技术特异性敲低了胎盘中CBS表达，观察小鼠的妊娠结局，结果显示:(1)胎盘CBS特异性敲低后不会影响孕期。(2)与对照组（Cbsf/f♂×Cbsf/f♀）相比，胎盘CBS敲低交配组（Cbsf/f♂×Cbsf/f;Tpbpa/A da-Cre♀和Cbsf/f;Tpbpa/Ada-Cre♂×Cbsf/f;Tpbpa/Ada-Cre♀）中，Cbsf/f;Tpbpa/Ada-Cre基因型胎盘重量及对应的胎儿体重都出现了不同程度的减少。(3)胎盘CBS敲低交配组中，胎鼠离乳前死亡率显著高于对照组。　　2.胎盘特异性CBS敲低没有导致子痫前期的临床表型。　　接下来观察胎盘CBS敲低是否导致子痫前期的临床表型。结果显示，与对照组（Cbsf/f♂×Cbsf/f♀)相比，Cbsf/f;Tpbpa/Ada-Cre♂×Cbsf/f;Tpbpa/Ada-Cre♀交配组孕鼠(1)GD17.5-18.5尿液中蛋白与肌酐的比值没有显著变化。(2)肾脏没有出现病理学损伤。(3)GD18.5天平均动脉压没有明显升高。(4)母体抗血管生成因子，血管生成因子的浓度都没有显著变化。　　二、CBS敲低损伤了胎盘结构　　1.CBS敲低损伤了胎盘结构。　　(1)胎盘CBS敲低后，迷路区域的面积减小，迷路区域与连接区域的比减小。(2)PAS染色显示CBS敲低的胎盘蜕膜中成簇的糖原滋养层细胞明显增多，并且连接区域出现组织空泡。(3)HE染色显示，与对照组相比，Cbsf/f;Tpbpa/Ada-Ce基因型胎盘合体滋养细胞围绕的母体血窦及血管内皮围绕胎儿血管面积显著减少;laminin免疫荧光结果显示Cbsf/f;Tpbpa/Ada-Cre基因型胎盘迷路中胎儿血管密度减少，同时血管变窄。　　2.GYY4137缓解了CBS敲低导致的胎盘结构损伤。　　妊娠期小鼠在从GD8.5到GD17.5腹腔给药GYY4137(50mg/kg)，结果显示GYY4137处理后，胎盘中蜕膜糖原滋养层细胞数目减少，连接区域空泡减少，迷路面积增大。同时，GYY4137处理后迷路的母体血窦和胎儿血管面积增大，胎儿血管密度增加，分布更加有序。　　三、CBS敲低损伤了子宫胎盘的血流动力学　　1.CBS敲低损伤子宫胎盘的血流动力学　　多普勒超声结果显示与对照组相比，Cbsf/f;Tpbpa/Ada-Cre♂×Cbsf/f;Tpbpa/Ada-Cre♀交配组孕鼠子宫胎盘的螺旋动脉血流速度、中央血管血流速度以及脐动脉最大血流、最小血流和平均血流速度都显著降低，同时脐动脉的搏动指数增加。　　2.GYY4137缓解了CBS敲低导致的子宫胎盘灌注不足　　GYY4137增加了螺旋动脉、中央血管以及脐动脉血流速度，同时减少了搏动指数。　　结论:　　根据以上研究，揭示了妊娠期胎盘中CBS敲低造成的血液循环中H2S水平降低会引起线粒体功能异常，影响胎盘发育，导致胎盘血流灌注减少，造成胎儿宫内生长受限。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分H2S对血氧饱和度和红细胞携氧能力的调节作用

前言

材料与方法

实验结果

讨论

小结

第二部分胎盘中CBS在宫内生长受限中作用的研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

综述 胎盘功能异常与宫内生长受限

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