眼球面部联合移植模型的建立与初步探讨

摘要

随着社会的发展，交通、高处坠落、暴力打击、工业生产事故的发生不断增加，而由外界暴力直接或间接作用于头面部而造成的头面部外伤亦日趋增多。若暴力损伤致额部或眼周，不仅会造成局部面部皮肤或器官的缺损，往往还会累及到视神经，造成创伤性视神经损伤，导致患者视力、视野受损，严重者甚至永久性视力丧失。所以如何能够保留这类伤者的视力，且尽可能修复面部的缺损，是急需解决的一个问题。　　目前临床上面部移植手术的发展已经较为成熟。截至到2016年底，在全球范围内已经成功进行了局部或全脸移植37例。与常规外科修复手术相比，面部移植手术可以更好的帮助患者恢复面部机能，重塑外表，患者只需通过一次移植手术就能够逐渐恢复吞咽、咀嚼等多方面的功能。眼球移植技术发展则较为缓慢，目前主要集中在基础研究阶段。最新的研究表明，在哺乳动物身上开展的眼球移植手术，已经被证实可以重建眼球的血供，部分视网膜电活动也可以被检测到，然而动物视力的恢复却一直难以达到。而这主要源自于视神经的不可再生性。　　视神经为特殊躯体感觉神经，是由视网膜神经节细胞(retina ganglion cell，RGCs)的轴突聚集而成。RGCs位于视网膜内，根据其所携带的来自相同光感受器的不同信息，可以分为至少18种不同的形态。然而每种RGCs都具有典型的神经元结构，它们是视网膜多种细胞中唯一一种能够引发动作电位的细胞。RGCs的树突数延伸在视网膜各层接受信号，然后通过一根很长的轴突（轴突聚集形成了视神经），经视交叉和视路延伸至大脑的特定区域产生视觉。然而作为一种神经细胞，RGCs跟一般神经细胞一样，其再生能力极弱。这是由于其内在发育特性低、细胞器动力学降低、低水平的神经营养因子支持以及神经胶质细胞产生的抑制性物质。因此，当视神经受损后，RGCs的轴突会发生进行的退化，最终导致细胞的凋亡，RGCs数量的大量减少，且无法逆转。　　也正因如此，人们越来越关注并研究视神经轴突的修复与再生机制，主要研究包括:1.神经保护药物:通过神经保护药物来防止RGCs进一步受损，并促进其恢复功能。如Weishaupt et al提出红细胞生成素就具有保护视神经和促进其再生的功能，通过给予红细胞生成素能棉线改善视神经损伤患者的视力;晶状体蛋白、钙通道拮抗剂也能发挥类似的功效;2.神经营养因子:目前已经发现了至少有20多种的神经营养因子可以促进RGCs的存活和轴突的再生。它们大多是通过改变神经细胞所处的微环境来发挥作用。Leibinger et al报道敲除小鼠的睫状神经营养因子(CNTF)基因后，会加速视神经RGCs的死亡，并抑制轴突的再生。Di Polo et al也报道应用脑源性神经营养因子(BDNF)后，可显著的提高视神经的存活，同时还可以促进神经干细胞的生长和分化;3.干细胞疗法:有文献报道在睫状体边缘区域和视网膜内存在视网膜干细胞，当视网膜发生损伤时，这类细胞会增生并分化成不同类型的感光细胞和视网膜细胞发挥修复作用。此外，胚胎干细胞、间充质干细胞等也都可发挥类似作用;4.外周神经移植:通过移植一段外周神经至损伤处，作为媒介来为再生轴突的延伸提供支撑作用，同时外周神经的施旺细胞也会产生一系列的神经营养因子，为轴突的再生提供促进作用，但试验结果表明效果较差。　　近年来，显微外科技术的发展和免疫调节理论的进步，以及神经再生领域的新发现，为精细的眼球面部联合移植手术的出现提供了可能。鉴于眼睛功能的高度专业化和其独特的解剖结构，以及面部缺损和失明所带来的心理创伤，同种异体的眼球面部联合移植手术会对这类患者其无功能眼球的恢复、替换和重建展现出巨大的吸引力和希望。因此，从短期目标为了探究促进视神经再生的新思路，更从长期目标使该手术成为临床现实，都有必要建立一个可靠的动物模型来测试该手术的可行性、具体效果，并进行评价，观察RGCs的存活情况。　　鉴于此，本课题组拟通过手术设计、模型建立、免疫荧光等技术和方法，完成眼球联合面部移植治疗视神经合并面部损伤的实验研究:1.眼球面部联合移植实验动物模型的设计与建立;2.眼球面部联合移植实验动物模型的评价与初步探讨。　　第一部分 眼球面部联合移植实验动物模型的设计与建立　　研究目的:本课题组提出以视觉功能单元为移植对象的概念，旨在设计并确立一套完整的、标准的手术方案，建立一个在体组织模型，通过提供在体带蒂的结构性组织，为视神经的重建提供解剖基础，并评价该手术方案及模型的可行性与稳定性。　　研究方法:30只成年健康的雄性Lewis大鼠、采用随机分组的办法分为供体组和受体组。通过供体眼球面部皮瓣的取材、受体眼球面部的准备以及眼球面部联合移植等步骤，完成眼球面部联合移植动物模型的建立。并评价大鼠血供重建情况、手术时间、出血量统计、术后大鼠瞳孔大小、对光反射情况及动物存活情况等。　　研究结果:①在掌握解剖结构的基础上，不断探索，制定了具体的手术方案。并借助手术显微镜、显微外科手术器械等设备实施该眼球面部联合移植手术方案，通过将获得的供体眼球及皮肤皮瓣迅速移植至受体的面部，并连接供血血管及神经，以完成眼球面部联合移植手术。②15组Lewis大鼠移植手术过程的操作时间、出血量平均为:供体眼球面部皮瓣的取材:手术时间1.02±0.16小时，出血量4.01±0.21毫升;受体眼球面部的准备:手术时间0.59±0.07小时，出血量1.35±0.12毫升;眼球面部联合移植:手术时间1.77±0.10小时，出血量平3.32±0.19毫升。③术后15只大鼠健侧眼睛瞳孔的直径平均为0.69±0.02mm，直接对光反射存在100％，间接对光反射存在0％;15只大鼠移植侧眼睛瞳孔的直径平均为3.06±0.17mm，直接对光反射存在0％，间接对光反射存在0％，眼球无光感，暂无视觉功能。15只大鼠在手术后3d、7d、14d、28d时的生存比率分别为:93.3％、93.3％、86.7％、80％。④术后大鼠皮肤温暖，颜色红润，有弹性;伤口分泌物少，无血肿形成，没有明显的黑紫或苍白;切口愈合良好，有毛发再生;大鼠体重正常，全身状况良好。血管重建较为成功，动脉供血良好，静脉回流通畅，组织血运基本正常。　　研究结论:通过血管重建和神经缝合等技术，初步建立了以视觉功能单元为移植对象的眼球-面部联合移植模型。该实验动物模型动脉血供良好，静脉回流通畅，组织血运基本正常，但暂无视觉功能。　　第二部分 眼球面部联合移植实验动物模型的评价与初步探讨　　研究目的:在上述模型的基础上，对该模型进行初步的探索，评估大鼠眼球面部联合移植手术后受体大鼠RGCs的存活情况，为手术效果及其可行性提供组织细胞学和分子生物学的结果支撑。　　研究方法:在Lewis大鼠眼球面部联合移植手术模型的基础上，采用随机对照分组的办法分为实验组（眼球面部联合移植动物模型）、对照组（大鼠面部做一个类似的手术皮瓣切口，但不剪断视神经）和空白组（无手术等任何处理），每组20只。分别于3天、7天、14天、28天时，取眼球、视神经标本进行免疫荧光染色，每次5只，对RGCs细胞进行计数比较，并同时测定他们GAP-43免疫荧光染色积分光密度值(IOD)。　　研究结果:①TUJ-1染色与RGCs计数:在3d、7d、14d和28d时，对三组大鼠的RGCs细胞进行计数:实验组:15.0±1.0、11.4±0.55、7.4±0.55、6.2±0.45;对照组:17.6±0.55、17.4±0.55、17.2±0.84、16.4±0.55;空白组:18.2±0.82、18.2±0.82、17.4±0.89、16.8±0.84。在3d、7d、14d和28d时，实验组和对照组的RGCs数量差异均具有统计学意义，P＜0.05。②视网膜GAP-43染色:在3d、7d、14d和28d时，实验组和对照组的视网膜GAP-43荧光强度的IOD值的差异均具有统计学意义，P＜0.05。③视神经GAP-43染色:在3d、7d、14d和28d时，实验组和对照组的视神经GAP-43荧光强度的IOD值的差异均具有统计学意义，P＜0.05。　　研究结论:在模型的基础上，该研究做了进一步的探索，检测到移植后视网膜神经节细胞随时间在不断减少，但仍有存活。该模型为进一步研究视觉功能提供了动物实验基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分：眼球面部联合移植实验动物模型的设计与建立

前言

一、材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、小结

第二部分：眼球面部联合移植实验动物模型的评价与初步探讨

前言

一、材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、小结

全文总结

参考文献

综述

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢