Obestatin对慢性心力衰竭大鼠肾脏水通道蛋白2的长时调控及其机制研究

摘要

慢性心力衰竭是多种心血管疾病的终末阶段，其中常见的原因是冠心病，特别是心肌梗死。慢性心衰预后较差，有统计表明整体生存率比恶性肿瘤更低。患者的生存质量逐年下降、医疗成本逐渐升高，引起社会的广泛关注。水潴留是心衰的重要病理生理机制，针对水潴留的利尿是心衰规范化治疗的基石。临床上最常用的袢利尿剂能选择性地阻断分布在髓袢升支管腔侧质膜上的Na+-K+-2CI-共转运子，抑制机体对氯化钠的重吸收，产生强大的利尿作用，但其应用也有一定的局限性。利钠治疗继发的低钠血症是影响心衰远期预后的危险因素，部分患者出现的利尿剂抵抗是临床常见的难题。因此，新的水代谢调控靶点和高效安全、特异性强的利尿药物研究一直是学术界关注的热点。　　水通道蛋白2(Aquaporin2，AQP2)分布于肾脏集合管主细胞的管腔顶质膜和胞浆的囊泡内，是调控集合管水通透性的关键通道蛋白，主要承担集合管腔水的重吸收和原尿浓缩的功能。AQP2在管腔顶质膜的分布及合成上调，进而增加水重吸收，是心力衰竭水潴留的最重要病理生理机制之一。针对调控AQP2蛋白开发的新型利尿剂显示出众多优越性，具有广阔的临床应用前景。　　肥胖抑制素obestatin是2005年由斯坦福大学张键博士等人发现的一种由23个氨基酸构成的多肽，经酰胺化修饰成为生物活性形式，在调节消化系统功能、体重变化、糖脂代谢、血管内皮功能等方面有广泛作用。中枢侧脑室给予obestatin可直接影响口渴中枢，减少机体的水摄入，同时通过抑制下丘脑的精氨酸加压素(AVP)的合成和释放，下调肾脏对水的重吸收。心力衰竭时外周循环obestatin水平升高，由于循环中obestatin不能通过血脑屏障进入中枢，那么外周循环obestatin对肾脏水重吸收是否有调节作用值得进一步研究。　　目的:目前在慢性心力衰竭机制研究中，关于obestatin和AQP2的作用鲜有报道。本课题旨在通过在体和体外实验，观察obestatin对水代谢和肾脏内髓AQP2的长时调控作用，通过基因芯片筛选差异表达基因以及基因沉默技术来分析其可能的调控机制。　　方法:利用临床常用器材，设计自制经口气管插管的定位防逆流装置和尾静脉穿刺用途的四联固定器，并在预实验中进行测试评估。采用开胸结扎前降支的方法构建大鼠急性心肌梗死模型，6周后通过心脏超声来筛选EF值≤45％的大鼠作为心力衰竭模型，随机纳入造模空白组、dDAVP组、V2受体拮抗剂组、obestatin高剂量组、obestatin低剂量组、NA-obestatin组、obestatin抗血清组等7组，加上假手术组共8组。分别尾静脉注射生理盐水、dDAVP、OPC31260、obestatin(200ug/kg)、obestatin(100ug/kg)、NA-obestatin、obestatin抗血清，连续注射14天。第15天（造模后第8周末）为实验终点并取大鼠肾脏内髓。实验全程定期测量尿量、体重，干预前后分别行心脏彩超检查及留取血尿样本。使用ELISA方法检测血BNP和血AVP水平，使用荧光定量PCR检测Aqp2基因表达，免疫组化和western blotting相对定量AQP2蛋白在肾脏内髓的表达情况。体外培养mIMCD3细胞，待细胞长至70％融合状态，无血清培养基空白12h后，分别给予不同时间节点(6h、12h、24h、36h、48h，10-7mmol/L的obestain)和不同干预措施(PBS、10-7mmol/L的obestatin、0.5×10-7mmol/L的obestatin、NA-obestatin、dDAVP、OPC31260、obestatin抗血清)的刺激，24h后分别提取RNA和蛋白，通过定量PCR和western blotting来检测AQP2基因和蛋白的表达水平。通过基因芯片对obestatin和PBS分别干预后的mIMCD3细胞mRNA进行差异表达基因筛查，通过生物信息学分析推测可能的调控机制并选取73个感兴趣的基因进行real-time qPCR验证。从验证后的基因中选取与水代谢密切相关的Pparg、V2r、Gpr39三个靶基因进行特异性敲减，观察obestatin调控AQP2表达的变化。　　结果:成功构建大鼠心梗后慢性心衰模型，成模率为51.16％。造模后8周，心衰模型各组间LVIDd、LVIDs、LVVold、LVVols、EF％、FS％等心功能指标以及血尿电解质组间比较无明显差异。Obestatin高剂量组与干预前相比24h尿量明显增加（75.18±8.51vs.40.77±5.49mL/kg，P＜0.001）。Obestatin高剂量组与造模空白组相比，血浆BNP浓度明显下降(1152.61±99.31vs.1504.54±85.62pg/mL，P＜0.001)，血浆AVP无明显变化（12.13±0.74vs.12.41±1.04pg/mL，P＞0.05）。Real-time qPCR及免疫组化、western blotting显示肾内髓AQP2基因和蛋白表达与造模空白组比较均下降。体外培养的IMCD3细胞经obestatin在不同时间点刺激后，AQP2基因和蛋白的表达量水平波动基本一致，与对照组(0h)相比，6h、12h、24h、36h和48h时间点AQP2的表达量显著降低(P＜0.05)，在6h-24h区间内，随着刺激时间的延长，其下降趋势越明显;但是36h后，其下降趋势呈现回升现象。体外培养的mIMCD3细胞分别给予不同措施刺激24h后，与假手术组相比，obestatin高剂量组、obestatin低剂量组以及OPC组AQP2基因和蛋白的表达量显著降低(P＜0.05)，与obestatin高剂量组相比，抗血清组AQP2基因和蛋白的表达量显著升高。在obestatin刺激后的mIMCD3细胞中表达差异有统计学意义的基因主要有Pparg、Aqp2、V2r、Fgf23、Myo1f、Slc8a1，可能参与长时调控的信号通路有FGF信号通路。敲减Pparg、V2r基因能使mIMCD3细胞的AQP2表达下调，同时给予obestatin刺激24h后，下调幅度更为显著。敲减Gpr39基因对mIMCD3细胞的AQP2表达无明显影响，但同时给予obestatin刺激后，能显著削弱obestatin对V2R、PPARG、AQP2的下调效应。　　结论:在体实验和体外实验证实了obestatin能下调肾脏内髓AQP2表达，在体实验还观察到利尿作用及心衰的生化指标好转。基因芯片筛查结果的生物信息学分析及定量PCR验证发现obestatin通过V2R与PPARG两条信号通路来下调IMCD3细胞的Aqp2基因表达，Myo1f、Slc8a1基因可能参与钙调蛋白结合和细胞骨架蛋白结合等分子生物学功能的调控。利用shRNA技术特异性敲减Pparg、V2r、Gpr39三个靶基因，在基因及蛋白水平证实了obestatin通过与GPR39受体相互作用来下调V2R、PPARG和AQP2的表达。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

参考文献

第一部分 Obestatin对慢性心力衰竭大鼠水代谢及肾脏AQP2的长时调控作用

一、材料和仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、小结

参考文献

第二部分 Obestatin对IMCD3细胞AQP2表达的调控及其机制研究

一、材料和仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、小结

参考文献

第三部分 shRNA特异性敲减靶基因对obestatin调控IMCD3细胞AQP2表达的影响

一、材料和仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、小结

参考文献

附录

全文小结

文献综述

攻博期间的研究成果

致谢