人类胚胎干细胞5-羟甲基胞嘧啶识别蛋白HMCES以及大肠杆菌单链DNA结合蛋白RecT的结构初探

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　1.人类胚胎干细胞5-羟甲基胞嘧啶识别蛋白HMCES的结构初探
　　表观遗传学修饰包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑等，其中DNA甲基化研究的最为深入。由于在甲基化以及去甲基化过程中的重要作用，5-甲基胞嘧啶(5mC)被称为第五种碱基，5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)被称为第六种碱基。5mC被TET酶进一步氧化为5hmC后，HMCES作为一个5hmC识别蛋白，能通过结合5hmC从而招募下游蛋白发挥功能，最终将5mC转换为普通的胞嘧啶。在这个过程中HMCES有肽酶活性，能通过自剪切来调控下游信号。这也是其独特之处。
　　本实验首先在体外克隆了HMCES的全长基因，构建了HMCES-MBP与HMCES两个载体，然后通过原核表达系统在体外进行了表达鉴定。我们首先对HMCES-MBP进行了纯化，发现蛋白在TEV酶酶切之后降解消失，因此我们又针对性地对HMCES的表达进行了优化，发现了HMCES的持续性降解现象。通过质谱分析、二级结构预测等手段找到HMCES稳定的酶解片段HMCES-276之后，我们对HMCES-276又重新进行了克隆、表达与纯化。在解决了HMCES-276的聚合问题之后，经过多次优化，通过晶体初筛最终得到了晶体，下一步衍射收到数据之后，即可通过结构解析揭示其功能基础，后续的工作正在进展当中。
　　2.大肠杆菌单链DNA结合蛋白RecT的表达纯化
　　外界环境和细胞内部的诸多因素经常会导致DNA分子的损伤或改变。为了应对DNA损伤，减小对细胞的影响，细胞在长期进化过程中，形成了多种DNA损伤的修复系统，包括光复活修复、碱基切除修复、核苷酸切除修复、重组修复、SOS修复、双链断裂修复等多种修复方式。其中重组修复途径在真核生物与原核生物中是不同的。在原核生物中，主要是通过Rec蛋白系列完成的，包括:RecABCD，RecFOR及RecET。RecT存在于大肠杆菌中，通过结合单链DNA，与RecE互相作用来促进互补的ssDNA复性。
　　对于该部分的工作，我们试图通过结构生物学的方法阐明RecT促进ssDNA复性的结构基础。我们首先采用原核表达系统，对RecT进行体外克隆以及表达纯化，但晶体筛选之后并没有得到晶体。我们又对初筛过程进行了优化，分别加入了稳定RecT的Mg2+以及RecT的底物ssDNA孵育，仍然没有长出晶体。此时我们转换思路，尝试对RecT的截短片段进行研究。我们分别克隆了RecT的两个截短片段，但在纯化过程中发现，只有RecT（94-C）可以稳定表达，随后对RecT-C片段进行了晶体筛选，目前后续的优化正在进行中，以期能拿到晶体通过X射线衍射晶体学的方法解析RecT结构，揭示其是如何发挥功能的。

目录

声明

摘要

第一篇 人类胚胎干细胞5-羟甲基胞嘧啶识别蛋白HMCES的结构初探

第一章 研究背景概述

1．1 表观遗传学简介

1．2 DNA的甲基化

1．3 DNA的去甲基化与5-羟甲基胞嘧啶

1．4 5hmC的识别蛋白HMCES

第二章 实验材料与方法

2．1 材料

2．2 仪器设备

2．3 方法

第三章 实验结果与讨论

3．1 HMCES基因的克隆及质粒构建

3．2 HMCES及HMCES-MBP蛋白的表达鉴定

3．3 HMCES-MBP蛋白纯化

3．4 HMCES蛋白纯化

3．5 HMCES蛋白稳定降解片段的确定

3．6 HMCES-276蛋白的纯化

3．7 HMCES-276蛋白的晶体初筛

本篇小结

参考文献

第二篇 的大肠杆菌单链DNA结合蛋白RecT的初步纯化

第一章 研究背景概述

1．1 DNA损伤修复简介

1．2 DNA重组修复简介

1．3 本篇拟解决的问题

第二章 实验材料与方法

2．1 材料

2．2 仪器设备

2．3 方法

第三章 实验结果与讨论

3．1 RecT基因的克隆及质粒构建

3．2 RecT及RecT-MBP蛋白的表达鉴定

3．3 RecT-MBP蛋白的初步纯化

3．4 RecT-MBP蛋白的进一步纯化

3．5 RecT的晶体初筛

3．6 RecT结晶优化

3．7 确定RecT蛋白的截短片段

3．8 RecT截短片段的纯化

3．9 RecT-C的晶体初筛

本篇小结

参考文献

附录

致谢