慢性脑低灌注致大鼠持续性认知受损及海马BAI1变化研究

摘要

研究背景与目的：　　脑卒中具有发病率高、死亡率高、致残率高的特点，是仅次于缺血性心脏病的全球第二大死因和伤残调整寿命年(disability adjusted life year，DALY)损失的第三大原因。随着临床研究的深入和医疗技术的进步，卒中的预防和治疗策略已取得长足进步。但是，庞大的脑卒中幸存患者仍然面临着认知功能下降甚至痴呆的巨大风险，严重影响着患者生存质量，并带来了沉重的医疗负担。　　慢性脑低灌注(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)是神经退行性疾病阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)和卒中后神经血管功能障碍性疾病血管性认知障碍(vascular cognitive impairment，VCI)的重要病理生理基础，但其相关机制仍不明确。在脑组织中高表达的脑特异性血管生成抑制因子1(brain specific angiogenesis inhibitor 1，BAI1)因其抗血管生成、抗肿瘤及参与免疫吞噬的作用而被广泛研究。近年研究发现BAI1在突触发生和突触可塑性中也发挥着重要作用。　　我们的前期研究发现，CCH所致实验动物认知功能受损与海马沉默突触与功能改变、线粒体老化、丝切蛋白棒状结构表达异常等有关。本研究拟在我们前期研究采用永久性双侧颈总动脉结扎(bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO)建立的CCH大鼠模型基础上，通过长时间动态观察实验动物的认知行为改变及相关海马结构BAI1表达和突触功能的变化特点，结合长期使用可调节突触可塑性的辛伐他汀干预效应，以进一步明确：(1)慢性脑低灌注状态持续3个月后，大鼠认知功能的变化特点；(2)慢性脑低灌注状态下突触前膜、突触后膜关键蛋白突触素(Synaptophysin，SYN)、突触后致密物95(postsynaptic density 95，PSD95)的表达变化；(3)BAI1在慢性脑低灌注模型大鼠中的表达情况，以及神经功能保护剂辛伐他汀干预后的变化；(4)探讨BAI1在VCI早期识别中的可能意义。　　材料与方法：　　将48只雄性SD大鼠按随机数字表法分为慢性脑低灌注组(CCH组，n=12)、假手术对照组(Sham组，n=12)、溶剂组(n=12)、辛伐他汀干预组(SV组，n=12)。(1)CCH组：结扎双侧颈总动脉；(2)Sham组：除不结扎双侧颈总动脉外，其余造模步骤与CCH组一致；(3)溶剂组：大鼠造模后给予溶剂0.5%羧甲基纤维素钠灌胃，持续3个月，排除溶剂本身对实验的干扰；(4)给药组：大鼠造模后给予辛伐他汀混悬液灌胃，持续3个月。行为学检测各组大鼠认知功能水平，蛋白免疫印迹实验检测BAI1及SYN、PSD95表达情况。　　结果：　　1.CCH致大鼠持续性学习记忆功能受损：旷场实验中，CCH组大鼠5分钟内移动总路程较Sham组减少(CCH组898.92±142.39cmvs.Sham组1268.54±210.52cm，P＜0.01)；定位航行实验获得性训练第1天至5天，CCH组大鼠参考记忆逃避潜伏期均比Sham组长，差异具有统计学意义(P＜0.05)，且均呈逐渐降低的趋势；空间探索实验中CCH组大鼠穿越平台次数和目标象限时间较Sham组均减少(CCH组2.58±1.44vs.Sham组3.50±1.73，P＜0.05；CCH组14.73±2.18vs.Sham组24.54±7.33，P＜0.01)；工作记忆实验中，CCH组大鼠与Sham组第1天逃避潜伏期无显著性差异，第2天前者时间较长，差异具有统计学意义(P＜0.05)，第3天与第4天差异性更加显著(P＜0.01)。　　2.辛伐他汀可有效保护CCH大鼠认知功能：旷场实验中SV组大鼠5分钟内移动总路程较溶剂组增加(SV组1228.10±258.70cmvs.溶剂组918.35±208.97cm，P＜0.01)；定位航行实验获得性训练第1天至5天，SV组大鼠参考记忆逃避潜伏期均比溶剂组短，差异具有统计学意义(P＜0.05)，且均呈逐渐降低的趋势；空间探索实验中SV组大鼠穿越平台次数和目标象限时间较溶剂组均增加(SV组3.33±1.67vs.溶剂组2.50±1.17，P＜0.05；SV组24.08±3.70vs.溶剂组15.03±5.05，P＜0.01)；工作记忆实验中，SV组大鼠与溶剂组第1天逃避潜伏期无显著性差异，第2天前者时间较短，差异具有统计学意义(P＜0.05)，第3天与第4天差异性更加显著(P＜0.01)。　　3.CCH持续3个月后，大鼠BAI1蛋白表达下降：蛋白免疫印迹实验结果显示，CCH组大鼠海马CA1区BAI1蛋白表达较Sham组降低，差异具有统计学意义(CCH组1vs.Sham组1.3641±0.0460，P＜0.01)。　　4.辛伐他汀干预后，CCH大鼠BAI1蛋白表达上升：蛋白免疫印迹实验结果显示，SV组大鼠海马CA1区BAI1蛋白表达较溶剂组升高，差异具有统计学意义(SV组1.3302±0.0319vs.溶剂组0.9946±0.0264，P＜0.01)。　　5.BAI1与突触前膜及突触后膜关键蛋白SYN、PSD95变化趋势一致：BAI1在CCH组、溶剂组中表达分别较Sham组、SV组表达降低，与SYN、PSD95在各组大鼠中的表达变化类似(SYN：CCH组1vs.Sham组1.4138±0.0689，P＜0.01；SV组1.3763±0.0532vs.溶剂组0.9800±0.0459，P＜0.01；PSD95：CCH组1vs.Sham组1.4969±0.0812，P＜0.01；SV组1.4295±0.0580vs.溶剂组1.0642±0.1204，P＜0.01)　　结论：　　1.CCH持续3个月后，大鼠自主探索及空间学习记忆能力仍显著受损，并存在明显的突触丢失；　　2.辛伐他汀可有效保护CCH大鼠持续性认知功能受损；　　3.在CCH致大鼠持续性认知功能受损过程中，大鼠海马CA1区BAI1蛋白表达下降，而神经功能保护剂辛伐他汀干预后BAI1表达增加，显示BAI1表达下调可能与CCH所致认知受损有关；　　4.BAI1与突触关键蛋白变化一致，有望成为血管性认知障碍早期识别生物标志及干预新靶点。

目录

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目 录

第1 章 绪论

1.1 学术背景及理论与实际意义

1.2 国内外文献综述

1.2.1 卒中后认知障碍的防治现状

1.2.2 慢性脑低灌注与血管性认知障碍

1.2.3 BAI1 与认知功能

1.2.4 辛伐他汀的神经功能保护作用

1.3 课题来源及主要研究内容

1.3.1课题来源

1.3.2主要研究内容

第2 章 实验方法

2.1实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 实验药物和试剂

2.1.3 实验主要仪器和器械

2.1.4 实验动物伦理

2.2 实验方法

2.2.1 实验分组

2.2.2 慢性脑低灌注大鼠模型的建立

2.2.3 给药剂量及方式

2.2.4 动物处理及样本取材

2.2.5 行为学检测

2.2.6 大鼠海马组织全蛋白提取

2.2.7 微孔酶标仪法测定蛋白浓度

2.2.8 免疫蛋白印迹检测

2.2.9统计学分析

第3 章 实验结果

3.1双侧劲总动脉结扎3个月后大鼠认知功能显著受损

3.2 辛伐他汀可有效改善CCH大鼠认知水平

3.3 CCH 持续3 个月后，大鼠BAI1 蛋白表达下降

3.4 辛伐他汀干预后，CCH大鼠BAI1蛋白表达上升

3.5 BAI1 与突触前膜及突触后膜关键蛋白SYN、PSD95变化趋势一致

第4 章 全文讨论

4.1 CCH致大鼠持续性学习记忆功能受损

4.2 辛伐他汀对CCH大鼠具有良好的认知功能保护作用

4.3 BAI1 蛋白表达降低与CCH大鼠认知障碍的发生有关

4.4 BAI1 或可作为血管性认知障碍早期识别的标志和干预靶点

4.5 本研究的不足

4.6 展望

结 论

致 谢

参考文献

附录 缩略词表

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