针对FLT3-ITD阳性急性髓细胞白血病的激酶抑制剂药物学研究

摘要

急性骨髓性白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是由于髓性细胞通过克隆、增殖、异常分化等方式快速的渗透至骨髓，血液和其他组织（包括脾、淋巴结、肝脏等组织）为特点的造血系统异常的癌症。FLT3受体属于Ⅲ型受体酪氨酸激酶家族中成员，目前研究表明FLT3基因的表达异常、突变与AML的发生、发展及预后有密切关系。据统计大约1/3的AML患者具有该基因突变，这导致FLT3下游信号通路持续活化和细胞的恶性增殖，因此FLT3成为靶向治疗AML的重要靶点。由于FLT3突变在AML中表现突出具有强烈的临床需求，近几年来针对FLT3的药物开发取得了迅速发展。尤其是2016年2月19日，诺华公司开发的FLT3激酶抑制剂PKC412(midostaurin)被美国食品药品监督管理局(FDA)授予“突破性”地位用于治疗FLT3突变的AML患者，更加确证了FLT3激酶作为FLT3-ITD的AML的药物开发靶点的有效性。本论文主要围绕FLT3激酶抑制剂的理性设计和药物作用机制及克服耐药性等方面展开研究。
　　第一部分:针对FLT3-ITD突变的高选择性Ⅰ型激酶抑制剂CHMFL-FLT3-165的药物学研究
　　我们利用老药新用的理念通过高通量筛选的方法发现已上市药物Ibrutinib（BTK抑制剂）能够选择性的抑制FLT3-ITD突变的细胞，但对FLT3-wt的AML细胞的增殖无明显影响。但由于Ibrutinib对FLT3激酶的抑制活性在submicromolar。为了获得具有自主知识产权的、活性和选择性更好的FLT3激酶抑制剂，我们以Ibrutinib的母核为基础，设计并合成了优于Ibtutinib的新型TypeⅠ抑制剂CHMFL-FLT3-165，实验结果显示，该化合物选择性的对FLT3-ITD阳性的AML细胞有强烈的抑制增殖的活性，并且对FLT3-wt的细胞的没有显著的影响。同时CHMFL-FLT3-165对FLT3激酶介导信号通路有明显的影响，并将细胞周期阻滞在G0-G1期。动物模型试验中，该化合物在25mg/kg的剂量下，就能够抑制肿瘤在小鼠体内的生长(TGI=76％)。尽管，CHMFL-FLT3-165的作用活性非常强，但由于口服利用度等药物代谢性质不太理想，不适宜进一步的临床前开发研究。但作为一个先导化合物可以为我们提供一个很好的药物模板，为进一步开发高活性高选择性的FLT3激酶抑制剂提供基础。
　　第二部分:针对FLT3-ITD突变的临床前候选激酶抑制剂CHMFL-FLT3-122的药物学研究
　　前期得到的化合物CHMFL-FLT3-165尽管生物活性很好，但由于其药代动力学研究结果不理想，为了得到口服利用度等药物代谢性质更好的化合物，我们通过药物化学的方法对Ibrutinib的结构进一步进行优化，得到一个高活性高选择性的化合物CHMFL-FLT3-122，在细胞层次上，CHMFL-FLT3-122对FLT3-ITD阳性的细胞有很强的抑制增殖的作用，能够明显的抑制FLT3介导的信号通路，并将细胞周期阻滞在G0-G1期。并且该化合物对FLT3和CKIT激酶有很好的选择性，暗示该化合物可能会避免骨髓抑制等相关的副作用。随后，我们对最为关注的药物代谢动力学进行了初步的研究，实验结果显示，CHMFL-FLT3-122的口服利用度达到30％，半衰期T1/2(h)为1.4小时，并且在MV4-11细胞接种的异种移植瘤小鼠模型中，该化合物呈现剂量依赖性的抑制效果，而对小鼠体重没有明显影响。上述研究结果表明，CHMFL-FLT3-122会是治疗FLT3-ITD阳性的AML的一个潜在的临床候选药物。
　　第三部分:针对FLT3激酶多种突变的Ⅱ型激酶抑制剂CHMFL-FLT3-213的药物学研究
　　尽管目前PKC412已被FDA批准用于治疗FLT3突变导致的AML，但在前期的临床实验中，随着用药时间的延长，耐药现象也不断出现，其中一个原因就是由于FLT3激酶区发生了多种耐药突变，导致激酶抑制剂对FLT3的抑制作用减弱。为了进一步获能够克服FLT3激酶区多种耐药性突变，诸如FLT3gatekeeper F691L的耐药突变，我们又在Ibrutinib与FLT3的结合模式深入分析的基础上，设计合成了Ⅱ型抑制剂CHMFL-FLT3-213。实验结果表明CHMFL-FLT3-213不仅对原发性的FLT3-ITD、FLT3-D835Y/V/H等突变有强烈的抑制作用，并且对耐药突变如FLT3-ITD-F691L/D835Y等突变也有很强的抑制作用。并且，该化合物依然能够对MOLM-13，MOLM-14和MV4-11有很强的抑制增殖作用，将细胞周期阻滞在G1-G1期，诱导细胞凋亡。体内实验也显示了良好的口服生物利用度F=18.8％。在MV4-11接种的动物模型中，3.5mg/kg的剂量下就能够明显的抑制小鼠体内肿瘤生长。上述研究表明，CHMFL-FLT3-213为临床上治疗FLT3突变呈阳性的AML，尤其是针对耐药突变的AML提供了一个新工具和研究思路。
　　第四部分:能够克服FLT3配体引起的FLT3激酶抑制剂耐药的已知化合物A674563的发现及其作用机制研究
　　对于FLT3抑制剂在临床研究中出现的耐药问题，除了激酶区发生的获得性耐药突变外，由FLT3配体引起的微环境耐药也是目前FLT3激酶抑制剂的所面临的问题之一。这是由于病人用药后体内的FLT3配体(FLT3-1igand，FL)水平的上升，从而重新激活wt-FLT3信号通路，包括AKT等。基于此，我们采用老药新用的理念，对现有的AKT抑制剂进行测试，发现“老药”A674563能选择性的抑制FLT3-ITD突变的阳性细胞系。并在FL存在的条件下，该化合物仍然显示出很强的抑制活性。提示A674563能够通过同时抑制AKT和FLT3激酶来克服此类耐药性。在动物模型中也表现出很好的抑制肿瘤增殖的活性。该项研究工作表明A674563无论是在细胞水平还是在动物模型上均表现出较强的抗肿瘤活性，为研究FLT3激酶提供了新工具，为AML的治疗提供了新的候选药物。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 研究背景及意义

1．1．1 急性髓细胞白血病(AML)的流行病学研究及其发病机制

1．1．2 FLT3激酶的结构和功能

1．1．3 FLT3激酶是AML发病的重要靶点

1．2 FLT3激酶抑制剂的研究现状

参考文献

第二章 针对FLT3-ITD突变的高选择性Ⅰ型激酶抑制剂CHMFL-FLT3-165的药物学研究

2．1 引言

2．2 实验材料及方法

2．3 实验结果

2．3．1 新型FLT3激酶抑制剂CHMFL-FLT3-165的设计思路

2．3．2 CHMFL-FLT3-165的生化特征和选择性分析

2．3．3 CHMFL-FLT3-165细胞增殖活性的检测

2．3．4 CHMFL-FLT3-165对FLT3-ITD阳性细胞中相关信号通路的影响

2．3．6 CHMFL-FLT3-165对细胞凋亡的影响

2．3．8 CHMFL-FLT3-165对FLT3-ITD+突变的病人原代细胞的影响

2．3．9 CHMFL-FLT3-165对小鼠移植瘤的影响

2．4 结论与讨论

第三章 针对FLT3-ITD突变的临床前候选激酶抑制剂CHMFL-FLT3-122的药物学研究

3．1 引言

3．2 实验材料和方法

3．3 实验结果

3．3．1 FLT3激酶抑制剂OHMFL-FLT3-122的设计策略

3．3．2 CHMFL-FLT3-122的选择性分析

3．3．3 CHMFL-FLT3-122细胞增殖活性的检测

3．3．4 CHMFL-FLT3-122对FLT3-ITD阳性细胞中相关信号通路的影响

3．3．6 CHMFL-FLT3-122的药代动力学研究

3．3．7 CHMFL-FLT3-122对小鼠移植瘤的影响

3．4 结论与讨论

第四章 针对FLT3激酶多种突变的Ⅱ型激酶抑制剂CHMFL-FLT3-213的药物学研究

4．1 引言

4．2 实验材料和方法

4．3 实验结果

4．3．1 Type Ⅱ型激酶抑制剂CHMFL-FLT3-213的理性设计

4．3．2 CHMFL-FLT3-213选择性分析

4．3．3 CHMFL-FLT3-213细胞增殖活性的检测

4．3．4 CHMFL-FLT3-213对FLT3-ITD阳性细胞中相关信号通路的影响

4．3．6 CHMFL-FLT3-213的药代动力学研究

4．3．7 CHMFL-FLT3-213对小鼠移植瘤的影响

4．4 结论与讨论

参考文献

第五章 克服FLT3配体引起的FLT3激酶抑制剂耐药性的老药A674563的发现及其耐药性机制研究

5．1 引言

5．2 实验材料和方法

5．3 实验结果

5．3．1 A674563对AML细胞的抗增殖活性和生化性质的检测

5．3．2 A674563对FLT3信号通路的影响

5．3．3 A674563对FLT3-ITD／wt AML细胞凋亡和周期的影响

5．3．4 TCS359和MK2206药物组合的研究

5．3．5 A674563能克服由FLT3 Ligand(FL)水平增加引起的耐药

5．3．6 A674563对FLT3-ITD+病人原代细胞的影响

5．3．7 A674563对鼠移植瘤的影响

5．4 结论与讨论

参考文献

致谢

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