酶促自组装紫杉醇水凝胶的合成与应用

摘要

紫杉醇是临床上治疗肿瘤的有效化疗药物，不仅对多种肿瘤具有显著的抑制效应，而且能显著地增加肿瘤对放疗的敏感性。所以针对紫杉醇的药物设计研究一直是药物合成研究的热点，产生了大量的紫杉醇衍生药物。这些药物大多虽然具有与紫杉醇类似的结构和生物学效应，但很少探究这些紫杉醇类似物的作用机制、毒副作用等是否与紫杉醇相似等问题。本研究合成了多肽链共价修饰的紫杉醇水凝胶，研究过程中发现其对神经元分支的影响和紫杉醇具有统计学意义上的差异，这对紫杉醇衍生药物临床应用研究具有重要意义，故此我们开展了相关机制研究。
　　本研究首先合成了紫杉醇水凝胶因子—化合物1(FmocFFK(taxol)Y(H2PO3))，该因子在碱性磷酸酶的作用下，脱去磷酸根，形成化合物2(Fmoc-FFK(taxol)Y(OH))，在溶液中能自动聚集组装成纳米纤维结构，从而形成超分子水凝胶。超分子水凝胶是小分子的凝胶因子通过非共价结合，如氢键、π-π堆积和静电等作用，相互结合，形成具有一定形态的超分子，由于小分子的生物兼容性较好，易代谢，故非常适宜于作药物载体。化合物1酶促自组装形成纳米纤维结构是化合物2通过氢键、π-π堆积或静电相互堆积形成的纳米纤维状结构，属于超分子水凝胶。金属负染冷冻电镜观察结果显示，纳米纤维直径约为7.2纳米，可能为一种中空的管状结构。
　　化合物1对C57BL/6胎鼠脑皮层神经元突起的形成具有促进作用，与紫杉醇具有显著的差异性，但两者均能促进神经元突起延长，导致神经元突起总长度无显著差异。为了探索造成这种差异在细胞层次的机理，我们比较分析了化合物1和紫杉醇这两种化合物在细胞毒性、细胞迁移、细胞内微管聚集等方面的差异，结果显示，两者无显著的统计学差异。为了进一步明确化合物1促进神经元分支的机理，我们利用微管蛋白在正常体温时组装、在低温时解组装的这一特点，提取了大鼠脑组织的微管，开展了体外微管组装实验，实验数据显示两者之间对微管体外组装的速度有显著影响:化合物1对微管体外组装具有明显的延迟效应。这提示，微管衍生物可能不仅具有促进微管蛋白纵向上连接和横向上连接，还有可能在时间上具有延迟的效应。为了确定是否是化合物1裂解后产生的影响，我们使用本实验室带有荧光的多肽链紫杉醇水凝胶化合物3(AC-Arg-Val-Arg-Arg-Cys(StBu)-Lys(taxol)-2-cyanobenzothiazole，CBT-Taxol）与微管结合蛋白已转染红色荧光蛋白的细胞进行共定位分析，分析结果显示两者共定位于细胞内(R=9.1)，这说明化合物3至少有一部分是直接与微管结合的。据此我们推测化合物1或者化合物2至少有部分可能是与微管直接相结合的。化合物1与紫杉醇促进神经元分支上的差异，可能是与这部分化合物与微管蛋白相互作用的结果。
　　依据已有的数据和前人的工作，我们推测化合物1促神经元分支的可能机制如下:化合物1在细胞内通过酶解脱磷酸根形成化合物2并组装成纳米纤维结构，这种纳米纤维结构一方面因为体积过大，在微管内腔中可能影响其他蛋白酶的活动范围，如乙酰化酶，或者超过两根纤维本身就无法被接纳的状态，延迟微管组装;另一方面，微管蛋白单体与化合物1(2)结合后，可能在微管正端端口大量聚集，干扰微管蛋白之间的聚集，从而影响微管的组装。所以化合物1最终可能是通过延迟微管组装，来促进神经元分支。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 紫杉醇药物的发现及应用研究

1．1．1 紫杉醇的发现

1．1．2 紫杉醇的作用机理

1．1．3 紫杉醇衍生药物的研究

1．2 超分子水凝胶及其在药物载体上的应用研究

1．3 紫杉醇超分子水凝胶载体及其衍生物的研究

1．4 紫杉醇对神经系统的影响

1．5 影响神经元分支的因素

1．6 课题的提出

参考文献

第二章 酶促自组装紫杉醇水凝胶的合成

2．1 前言

2．2 实验方法

2．2．1 试剂及仪器型号

2．2．2 化合物的合成步骤

2．2．2 化合物在不同pH条件下的稳定性

2．2．3 化合物的酶解

2．2．4 化合物的水凝胶特性

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 化合物1和化合物2的多肽链合成结果

2．3．2 化合物1和2在不同pH条件下的稳定性

2．3．3 化合物1的酶解

2．3．4 化合物1酶解水凝胶电镜观察

2．3．5 纳米纤维空间结构

2．4 本章总结

参考文献

第三章 紫杉醇水凝胶促进神经元分支

3．1 前言

3．2 实验方法

3．2．1 神经元元代培养

3．2．2 药物实验

3．2．3 神经元免疫组化成像实验

3．2．4 神经元形态分析

3．2．5 统计方法

3．3 实验结果与讨论

3．3．1 紫杉醇、化合物1促进神经元微管组装

3．3．2 神经元追踪分析结果与讨论

3．4 本章小结

参考文献

第四章 酶促自组装紫杉醇水凝胶促神经元分支的机理研究

4．1 前言

4．2．1 实验材料

4．2．2 细胞培养

4．2．3 细胞毒性实验

4．2．4 细胞迁移实验

4．2．5 细胞显像

4．2．6 微管体外组装实验

4．3．1 细胞毒性实验

4．3．2 细胞迁移实验结果

4．3．3 细胞成像结果

4．3．4 微管体外组装实验

4．4 本章小结

参考文献

五章 紫杉醇水凝胶与微管共定位

5．1 前言

5．2．1 实验材料

5．2．2 化合物细胞成像

5．2．3 荧光成像共定位分析

5．3 实验结果与讨论

5．3．1 化合物3导致大量细胞死亡

5．3．2 化合物3与细胞微管结合蛋白共定位

5．3．3 化合物3在细胞内可能没有彻底释放紫杉醇

5．3．3 本章小结

参考文献

第六章 总结与展望

附录

致谢

在读期间发表的学术论文