维吉尼亚链霉菌诱变育种及发酵工艺优化的研究

摘要

维吉尼亚霉素（virginiamycin，简称VGM）是一种由维吉尼亚链霉菌（Streptomyces virginiae）经发酵产生的内脂环肽类的链阳性抗生素，由多种组分组成的化合物，主要是由巨环内脂类的M1因子和环状多肽类的S1因子构成。VGM因具有结构新颖、安全无毒，不易产生耐药突变株等特点，是一种不可多得的应用前景良好的动物饲料添加剂。目前我国每年大量进口该产品，使用成本较高，因此对维吉尼亚链霉菌进行诱变选育以及开展发酵工艺优化研究具有十分重要的社会效益与经济效益。
　　本课题首先建立了一种高通量筛选方法，即利用24孔板作为诱变菌株的微型培养平台，再结合管碟法和高效液相色谱法(HPLC)作为维吉尼亚霉素检测和筛选方法，以期筛选高产VGM的突变株。管碟法简单方便易于观察，主要用于大量诱变菌株的初筛，可以快速提高筛选效率。HPLC检测方法准确灵敏，因此将其作为VGM的定量检测方法。其次，利用单因素实验确定24微孔板培养体系最佳发酵培养基装液量为1.25mL，最佳接种量为5％，最佳发酵时间为30h，最佳转速为240rpm，通过相关实验发现，采用24孔板的微量培养体系用于大量菌株的快速筛选是可行和有效的，具有明显的优势。
　　本课题以维吉尼亚链霉菌FL3为出发菌株，根据生物合成代谢途径及代谢调控育种的基本理论，运用紫外、微波、亚硝酸钠等多种诱变因子进行菌种选育，并以前体、硫酸链霉素等作为抗性筛选剂，使维吉尼亚链霉菌产VGM的能力不断提高，最终选育出了一株遗传稳定的耐硫酸链霉素的高产菌株MWS178。该菌株的发酵单位为146.72ug/mL，比出发菌株的发酵单位提高了6倍左右。同时发现基于硫酸链霉素的微波诱变正突变率高达32.83％，更易获得高产VGM的突变菌株。
　　本课题对维吉尼亚链霉菌MWS178发酵培养基以及培养条件进行了优化，通过单因素实验考察了接种量、碳源、氮源等对发酵的影响，得出最佳的发酵培养基(g/L):葡萄糖10，可溶性淀粉10，黄豆饼粉20，酵母浸膏10，NaCl2.5，pH7。最佳的摇瓶培养条件:种龄16h，接种量5％,装液量为30mL/250mL三角瓶，温度为28℃，发酵48h。基于以上优化后的发酵工艺，菌株MWS178最终产VGM高达460.23ug/mL，较原始发酵工艺条件的发酵单位提高了3倍多。近年来，有关稀土元素对微生物发酵的影响的报道逐年增加。本课题进一步首次考察了6种稀土元素对VGM产量的影响。研究结果表明，不同稀土元素对VGM产量产生的效果是不同的，其中发酵前向发酵培养基中添加200mg/L氯化铯或300mg/L硝酸钐或3mg/L氯化锶或10mg/L氯化镧，VGM产量较对照相比分别提高了13.13％，22.64％，23.91％，32.60％，进一步研究发现氯化镧最佳的添加时间为发酵初期。在发酵初期添加10mg/L氯化镧，菌株MWS178产量高达610.28ug/mL，比出发菌株FL3产量提高了28倍左右。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 VGM的理化性质、作用机制与安全性

1．1．1 VGM的化学结构

1．1．2 VGM的理化性质

1．1．3 VGM抑菌作用机制

1．1．4 VGM的安全性

1．2 VGM的发酵研究概况

1．2．1 VGM的生物合成途径

1．2．2 国内外发酵法生产VGM的研究进展

1．3 抗生素抗性筛选的研究

1．4 稀土元素对微生物的生物学作用研究

1．5 本论文研究的目的、意义和内容

1．5．1 研究的目的与意义

1．5．2 本论文研究的内容

2．1 实验材料

2．1．1 菌种

2．1．2 试剂和仪器表

2．1．3 培养基及培养条件

2．2 实验研究方法

2．2．1 维吉尼亚链霉菌种的保藏方法

2．2．2 发酵液中维吉尼亚链霉菌生物量测定方法

2．2．3 HPLC法测VGM含量的确定

2．2．4 管碟法测定VGM的生物活性

2．2．5 诱变选育

第三章 高通量筛选方法的建立

3．1 HPLC法测定维吉尼亚霉素含量方法的确定

3．1．1 检测条件的确定

3．1．2 标准样品及发酵液样品的分离色谱图

3．1．3 维吉尼亚霉素HPLC检测的标准曲线

3．2 管碟法测定维吉尼亚霉素含量方法的确定

3．2．1 敏感菌培养时间的确定

3．2．2 敏感菌加入量的确定

3．2．3 抑菌圈直径大小与维吉尼亚霉素浓度的关系

3．3 多孔板培养方法的确定

3．3．2 24孔板发酵培养基装液量对VGM产量的影响

3．3．3 24孔板发酵培养摇床转速的确定

3．3．4 发酵时间对VGM产量的影响

3．3．5 接种量对24孔板发酵产VGM的影响

3．3．6 深孔板微量培养体系用于菌株快速筛选的可行性分析

3．4 本章小结

第四章 维吉尼亚霉素高产菌株的诱变育种及筛选

4．1 出发菌株的筛选

4．2 最小抑菌浓度(MIC)的确定

4．2．1 2-脱氧 D-葡萄糖最小抑制浓度的确定

4．2．2 氨基乙酸最小抑制浓度的确定

4．2．3 前体及其结构类似物最小抑制浓度的确定

4．2．3 硫酸链霉素最小抑制浓度的确定

4．3 紫外线诱变选育VGM生产菌

4．3．1 紫外线诱变剂量的选择

4．3．2 紫外线诱变菌株的筛选结果

4．4 微波诱变选育VGM生产菌

4．4．1 微波诱变剂量的选择

4．3．2 微波诱变菌株的筛选结果

4．5 亚硝酸钠诱变选育VGM生产菌

4．5．1 亚硝酸钠诱变时间的选择

4．4．2 亚硝酸钠诱变菌株的筛选结果

4．6 基于硫酸链霉素的三种诱变模型的诱变效果的比较

4．6．1 紫外诱变、微波诱变和亚硝酸钠诱变筛选结果

4．6．2 链霉素抗性突变株微孔板初筛的结果

4．6．3 链霉素抗性突变株摇瓶复筛的结果

4．7 传代稳定性试验

4．8 本章小结

第五章 VGM发酵培养条件的优化

5．1 种子质量对发酵的确定

5．1．1 种龄的优化

5．1．2 接种量的优化

5．2 发酵培养基的优化

5．2．1 碳源的优化

5．2．2 氮源的优化

5．3 发酵条件的优化

5．3．1 溶氧对发酵的影响

5．3．2 初始pH对发酵的影响

5．3．3 温度对发酵的影响

5．3．4 发酵时间的确定

5．4 稀土元素对发酵的影响

5．4．2 CsCl3对VGM发酵的影响

5．4．3 Sm(NO3)3对VGM发酵的影响

5．4．5 ErCl3对VGM发酵的影响

5．4．6 LaCl3对VGM发酵的影响

5．5 本章小结

结论和展望

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果