玳玳花精油的组分分析及对结肠癌细胞抑制作用研究

摘要

玳玳是芸香科柑橘属酸橙的变种，玳玳的产花量大，玳玳花含有丰富的香气和活性成分，每年的疏花量加上生理落花造成巨大的资源浪费，将玳玳花加工成精油可高效利用资源，增加其经济价值。挥发性成分组成和含量差异是影响精油品质的重要因素，与提取方法和原料密切相关。本文通过水上蒸馏、共水蒸馏、超声辅助共水蒸馏方法提取玳玳干花得到精油样品A、B、C，超声辅助共水蒸馏提取不同树龄的玳玳鲜花得到精油样品D、E、F、G，水上蒸馏提取玳玳鲜花得到精油样品H，采用气相质谱-离子迁移谱(GC-IMS)技术和气相质谱(GC-MS)技术比较分析了这八种精油样品的挥发性组分，为根据不同香气组分需求选择精油提取的方式和原材料提供参考。比较各精油样品对人结肠癌细胞SW480细胞活力的影响，并从线粒体信号通路对精油样品诱导SW480细胞的凋亡进行研究。主要研究结果如下：　　1.水上蒸馏、共水蒸馏和超声辅助共水蒸馏三种方式提取玳玳干花精油的得率分别为0.38%、0.41%、0.44%；选用精油得率最高的超声辅助共水蒸馏法提取不同树龄的玳玳鲜花精油，得率分别为一年生(0.47%)、二年生(0.33%)、三年生(0.38%)、四年生(0.24%)，其中一年生鲜花精油得率最高；水上蒸馏提取的玳玳鲜花精油得率为(0.40%)，高于干花精油。　　2.GC-IMS技术检测出水上蒸馏提取的玳玳干花精油挥发性组分种类较少，但部分如正丁醇、乙醇、己醛、香茅醛、乙酸丙酯、丙酸乙酯等呈现酒香、果香、花香的组分含量较高；共水蒸馏提取的玳玳干花精油中α-蒎烯、戊醛、甲基庚烯酮、甲基异丁基酮、异戊醛等呈现花果清香的组分含量更高；超声辅助共水蒸馏提取的精油挥发性组分与共水蒸馏相似，但超声辅助提取的组分种类最多，且乙酸乙酯和苯乙酸乙酯等含量更高使其有更浓烈的酒香和蜜香。以上结果可以为不同目标香气组分选择相应提取方式提供参考。四年生玳玳鲜花精油香气组分种类和含量在所有树龄的精油中最丰富，柠檬烯、丙醇、甲基庚烯酮、2-己酮、苯乙酸乙酯、α-蒎烯、苯乙醛等呈现的果香、青香、薄荷香、蜜香、花香和杏仁香更浓烈，是最适宜采摘提取精油的树龄；一年生次之，二年生和三年生玳玳鲜花精油特有组分少，且二年生鲜花精油含有较多刺激难闻物质，不适宜采摘提取精油。鲜花精油比干花精油的组分种类更多，香气更加清新、甜蜜，可优先选择作为精　　3.GC-MS技术检测八个玳玳花精油样品，一共鉴定出74种成分，包括25种萜烯类化合物、23种醇类、8种酯类、6种醛类、4种酮类、4种烷烃类、2种酸类、1种芳香烃和吲哚；其中β-蒎烯、β-月桂烯、柠檬烯、芳樟醇、萜烯醇、橙花乙酸酯、乙酸香叶酯、石竹烯、橙花叔醇等是八种精油共有的组分。　　4.八个精油样品均能显著抑制人结肠癌细胞SW480的细胞活力，抑制能力与精油浓度呈依赖性。各组精油对SW480细胞活力抑制能力的排序为：G＞H＞D＞A＞F＞E＞C＞B。不同提取方式中，水上蒸馏方式提取的精油对SW480细胞的抑制能力最强；不同树龄的玳玳鲜花中，四年生的玳玳鲜花精油对SW480细胞的抑制能力最强；玳玳鲜花精油对SW480细胞的抑制能力强于干花精油。　　5.玳玳花精油可以浓度依赖性的引起人结肠癌细胞SW480中ROS和Ca2＋含量升高，线粒体膜电位下降，并将细胞周期阻滞在S期，使Bcl-XL的mRNA和蛋白水平下调，Bid的mRNA和蛋白水平上调，CytoC和PARP的mRNA和蛋白表达量增加，进一步激活Caspase-9和Caspase-3使其mRNA和蛋白表达上升。说明玳玳花精油通过调控线粒体信号通路诱导SW480细胞的凋亡。　　综上，玳玳花精油含有丰富的芳香物质和活性成分在不同提取方式和原料提取的样品之间存在差异，能显著抑制人结肠癌细胞SW480活力，并通过线粒体通路诱导SW480细胞的凋亡，玳玳花精油有作为天然香精香料和抗肿瘤药物应用于食品、日化及医药行业的巨大潜力。油提取的原材料。　　3.GC-MS技术检测八个玳玳花精油样品，一共鉴定出74种成分，包括25种萜烯类化合物、23种醇类、8种酯类、6种醛类、4种酮类、4种烷烃类、2种酸类、1种芳香烃和吲哚；其中β-蒎烯、β-月桂烯、柠檬烯、芳樟醇、萜烯醇、橙花乙酸酯、乙酸香叶酯、石竹烯、橙花叔醇等是八种精油共有的组分。

目录

声明

中英文缩略对照表

第1章绪 论

1.1 玳玳的研究进展

1.1.1 玳玳简介

1.1.2 玳玳的生物活性

1.1.3 玳玳花精油

1.2 结肠癌

1.2.1 结肠癌的研究现状

1.2.2 天然产物对结肠癌细胞的作用

1.2.3 结肠癌与线粒体凋亡通路

1.3 研究目的意义及研究内容

1.3.1 研究目的与意义

1.3.2 研究内容

1.3.3 技术路线

第2章提取方式和原材料对玳玳花精油得率及组分的影响

2.1 材料与仪器

2.1.1 材料与试剂

2.1.2 仪器与设备

2.2 试验方法

2.2.1 玳玳花精油的提取

2.2.2 GC-IMS 分析玳玳花精油

2.3 结果与分析

2.3.1 玳玳花精油的得率

2.3.2 不同提取方式的精油组分对比

2.3.3 不同树龄玳玳花提取的精油组分对比

2.3.4 玳玳干花与鲜花精油的组分对比

2.3.5 八种玳玳花精油的组分离子迁移谱图和 PCA 分析

2.4 本章小结

第3章玳玳花精油的组分及其抗结肠癌活性分析

3.1 材料与仪器

3.1.1 材料与试剂

3.1.2 仪器与设备

3.2 试验方法

3.2.1 GC-MS 分析条件

3.2.2 细胞培养

3.2.3 药物处理及实验分组

3.2.4 CCK-8 法测定 SW480 细胞活力

3.2.5 统计学分析

3.3 结果与分析

3.3.1 玳玳花精油的组分及含量分析

3.3.2 玳玳花精油对 SW480 细胞活力的影响

3.3.3 玳玳花精油对 SW480 细胞抑制能力对比

3.4 本章小结

第4章玳玳花精油诱导人结肠癌细胞 SW480 凋亡的研究

4.1 材料与仪器

4.1.1 材料与试剂

4.1.2 仪器与设备

4.2 试验方法

4.2.1 细胞内活性氧的检测

4.2.2 细胞内钙离子浓度的检测

4.2.3 线粒体膜电位的检测

4.2.4 细胞凋亡的检测

4.2.5 细胞周期的检测

4.2.6 细胞中凋亡相关基因 mRNA 表达

4.2.7 细胞中凋亡相关蛋白表达

4.2.8 统计学分析

4.3 结果与分析

4.3.1 玳玳花精油对细胞内活性氧生成的影响

4.3.2 玳玳花精油对细胞中钙离子浓度的影响

4.3.3 玳玳花精油对线粒体膜电位的影响

4.3.4 玳玳花精油对细胞凋亡的影响

4.3.5 玳玳花精油对细胞周期的影响

4.3.6 玳玳花精油对细胞凋亡相关基因的影响

4.3.7 玳玳花精油对细胞凋亡相关蛋白的影响

4.4 本章小结

结 论

一、主要结论

二、论文创新点与展望

参考文献

附录 A 攻读学位期间所发表的学术论文

致谢