乙型肝炎病毒促进肝细胞PD-L1表达的机理

摘要

乙型肝炎病毒(HBV)属于DNA病毒，由于HBV对自身生活周期能进行精密的调控以及感染宿主时高度的专一性，并且其感染后具有长期的潜伏性以及持续的感染性，至今为止还没有研究出完全消除病毒的方法。同时，在HBV感染过程中，由于其会与宿主相互作用从而达到一种协同进化影响，自身会演化出多种逃避免疫的策略。　　人体免疫系统由先天性免疫系统和获得性免疫系统所组成，它们都对HBV起到监视、防御和清除的作用。一方面，HBV能通过HBVX蛋白(HBx),HBVS抗原(HBsAg),HBVe抗原(HBeAg)和HBV核心蛋白(HBcAg)等病毒蛋白与先天免疫信号通路中多个信号分子发生相互作用，逃避干扰素对自身的杀伤作用以及促进其它病毒对宿主的感染。另一方面，HBV通过调节感染细胞内多种免疫检查分子的表达，抑制免疫细胞的免疫监视与免疫杀伤。轴抑制蛋白(Axin)调控的信号转导通路和PD-L1在生物体生长与发育过程中发挥极为重要的作用，某些病毒和肿瘤能借助它们进行免疫逃逸。通过研究我们发现在HBV免疫逃逸过程中Axin与PD-L1也扮演着重要角色。　　本研究主要从HBV逃避免疫监视和免疫杀伤入手，探究其具体机制。在本研究中，我们对HBV调控肝细胞内PD-L1的表达机理进行了探讨。我们发现，HBV感染对肝细胞内Axin和PD-L1的mRNA水平没有影响，但可下调肝细胞内Axin的蛋白水平，同时上调PD-L1的蛋白水平。在此基础上，我们在肝细胞中过表达HBV的1.3倍复制子，我们发现对Axin与PD-L1在mRNA水平上依旧没有影响，而在蛋白水平上，与对照组相比，Axin蛋白出现下调现象而PD-L1蛋白出现上调现象。另一方面，由于HBx对HBV的生活周期以及在HBV感染宿主的过程中发挥重要的作用，于是我们对其进行了探究，在肝细胞中过表达HBx，与对照组相比，我们发现HBx下调Axin的蛋白水平，同时上调PD-L1蛋白水平。因此，我们猜测此类现象存在着一定的因果关系，于是，我们在HBV稳定感染的肝细胞中过表达Axin，结果表明过表达Axin能逆转PD-L1上调的现象。通过初步研究，我们发现Axin能调节PD-L1的表达。于是，我们对Axin影响PD-L1这一现象的具体机制进行了探讨，通过从转录、翻译以及翻译后修饰等水平进行验证，我们发现过表达Axin能影响PD-L1的泛素化降解过程，然后我们对PD-L1的去泛素化和泛素化过程进行了初步研究，我们发现过表达Axin上调PD-L1的E3泛素连接酶SPOP的蛋白水平,继而下调PD-L1蛋白水平。进一步研究发现Axin促进PD-L1的K48依赖的泛素化降解作用。基于上述研究结果，我们认为HBV可能通过X蛋白(HBx)下调Axin和SPOP蛋白水平，抑制PD-L1泛素化降解，进而逃逸宿主免疫应答。　　本研究揭示了HBV免疫逃逸新机制，为探究HBV的治疗手段提供了一个新的思路前景。

目录

声明

第1章 绪论

1.1 乙型肝炎病毒的概述

1.1.1 乙型肝炎病毒简介

1.1.2 乙型肝炎的现行状况

1.1.3 乙型肝炎病毒与免疫

1.2 Axin蛋白概述

1.2.1 Axin蛋白的结构

1.2.2 Axin在信号通路中的作用

1.3 PD-L1蛋白的概述

1.3.1 PD-L1蛋白的结构

1.3.2 PD-L1与CHB的关系

1.4 课题研究的目的及方案

第2章 Axin与PD-L1的表达呈负相关

2.1 前言

2.2 实验材料

2.2.1 实验试剂与耗材

2.2.2 仪器设备

2.3 实验方法

2.3.1 HBV感染方法

2.3.2 RNA的提取

2.3.3 RNA逆转录

2.3.4 荧光定量PCR

2.3.5 蛋白质提取

2.3.6 蛋白质浓度测定

2.3.7 Western Blot免疫印迹实验

2.3.8 统计学分析

2.4 实验结果

2.4.1 Axin过表达质粒的鉴定

2.4.2 在HBV感染的肝癌细胞中，Axin与PDL1的表达呈负相关

2.5 小结与讨论

第3章 Axin通过泛素化蛋白酶体途径降解PD-L1

3.1 前言

3.2 实验材料

3.2.1 实验试剂与耗材

3.2.2 仪器设备

3.3 实验方法

3.3.1 PD-L1过表达载体质粒的制备

3.3.2 RNA提取

3.3.3 RNA逆转录

3.3.4 荧光定量PCR

3.3.5 蛋白质提取

3.3.6 蛋白质浓度测定

3.3.7 Western Blot免疫印迹实验

3.3.8 蛋白免疫沉降实验

3.3.9 病人肝癌与癌旁组织样本检测

3.3.10 统计学分析

3.4 实验结果

3.4.1 PD-L1过表达质粒的构建鉴定

3.4.2 Axin通过泛素化蛋白酶体途径降解PD-L1

3.5 小结与讨论

第4章 Axin调节PD-L1泛素化的机制

4.1 前言

4.2 实验材料

4.2.1 实验试剂与耗材

4.2.2 仪器设备

4.3 实验方法

4.3.1 CBL和SPOP过表达质粒的构建

4.3.2 RNA提取

4.3.3 RNA逆转录

4.3.4 荧光定量PCR

4.3.5 蛋白质提取

4.3.6 蛋白质浓度测定

4.3.7 Western Blot实验

4.4 实验结果

4.4.1 CBL和SPOP过表达质粒的构建与鉴定

4.4.2 Axin调节PD-L1泛素化的机制

4.5 小结与讨论

结论与展望

参考文献

附录 攻读硕士学位期间参与发表论文和专利

致谢