新型硫化氢和线粒体自噬荧光探针的设计合成及应用

摘要

绿色荧光蛋白(GFP)的发现以及荧光染料的化学标记作为活细胞成像的多功能工具，引发了生命科学和生物医学研究的一场革命。随着荧光探针工具箱和成像平台的不断发展使得无创且信息丰富的成像实验成为可能。在最近的十几年来，荧光探针分别在多个领域例如材料科学、生命科学、信息科学等许多领域产生重大的影响，荧光探针技术变成了炙手可热的生物医学研究工具，现在已广泛应用于细胞，葚至于生物活体的研究中也取得了不小的进展。　　H2S是一种无色，剧毒的酸性气体，带有令人不愉快的腐烂的鸡蛋气味。H2S甚至在低外源浓度下也会影响眼睛以及呼吸和中枢神经系统。H2S与NO和CO-起被认为是第三种多功能信号生物分子，因为它在人脑中起神经调节剂的作用，并被认为是人体生理学中的重要气体传输器。所以，实选择性识别和检测生物体内硫化氢在生物医学方面有着十分重要的意义。本文基以近红外氨基半花箐衍生物染料为荧光团，在其结构中引入叠氮为H2S的响应基团设计并合成了一种具有近红外激发和发射的硫化氢响应荧光探LW-N3。体外实验结果表明探针LW-N3在中性性缓冲溶液中对H2S具有水溶性好、高灵敏度、高选择性及快速响应的能力。细胞成像实验结果表探针LW-N3可以特异性地对线粒体中的H2S进行成像分析检测，是一种高灵敏度、高选择性并且水溶性好的线粒体靶向H2S响应有机荧光探针。　　线粒体自噬，这是一种发生在细胞内部的对于一些失去了正常功能的线粒体的清除的一种生理过程，该过程最终依赖溶酶体完成，这是细胞完成正常的生理代谢必要的过程。目前关于研究线粒体自噬的有机荧光小分子探针的研究还是比较浅的，它的主要的研究方法是基于探针在线粒体和溶酶体中对pH的响应，但是在自噬过程pH会发生改变，这就导致了探针检测自噬过程并不是单一变量性。因此，为了探索这个过程，我们基于生物正交化学反应合成了一种新型的荧光探针Rh-Tz，它是利用与Lvso-TCO发生逆电子需求的D-A化学反应来实现对线粒体自噬过程的监测，该探针的响应不受pH的影响。探针是以罗丹明为骨架的，其结构带有正电性可以靶向线粒体，故探针会在线粒体中富集，同时探针中的四嗪可以通过FRET效应淬灭探针的荧光。Lvso-TCO的设计中引入了的吗啉作为溶酶体靶向基团，其弱碱性导致了探针会在溶酶体中大量富集。当细胞发生自噬时，线粒体中会形成自噬体并最终和溶酶体发生融合，这就导致线粒体中的探针会和溶酶体中的的Lvso-TCO接触并发生生物正交的点击化学反应，这时探针中的四嗪结构被破坏，探针的荧光得以恢复，从而实现了对线粒体自噬的检测。

目录

声明

第1章绪论

1.2荧光探针理论概述

1.2.1荧光探针的组成

1.2.2荧光探针的传递机制

1.3硫化氢荧光探针研究进展

1.3.1硫化氢的还原反应

1.3.2硫化氢的亲核加成反应

1.3.3金属硫化物沉淀反应

1.4线粒体自噬荧光探针研究进展

1.4.1常见的生物正交化学反应

1.4.2基于Diels-Alder反应的线粒体自噬荧光探针研究进展

1.5课题的研究意义及内容

第2章新型硫化氢小分子荧光探针研究

2.2实验部分

2.2.2探针的合成路线

2.2.3硫化氢探针的光谱性质研究

2.3结果与讨论

2.3.1探针LW-N3的光谱性质

2.3.2探针LW-N3和H2S响应动力学研究

2.3.4探针LW-N3的选择性研究

2.3.5探针LW-N3对不同的pH值的稳定性研究

2.3.7探针LW-N3的细胞成像实验

2.4小结

第3章新型线粒体自噬荧光探针的设计合成和应用

3.2实验部分

3.2.2探针Rh-Tz的合成路线

3.2.3探针Rh-Tz的光谱性质研究

3.3结果与讨论

3.3.1探针Rh-Tz的光谱性质

3.3.2探针Rh-Tz的响应动力学及对不同PH稳定性研究

3.3.3探针Rh-Tz的机理验证

3.3.4探针Rh-Tz的线粒体共定位及细胞成像实验

3.3.5探针Rh-Tz的溶酶体共定位研究

3.4小结

第4章总结

参考文献

附录A硕士学位期间研究论文目录

附录B部分化合物谱图

致谢