TAT-FOXM1-C(688-748)重组蛋白纯化及其抗肿瘤活性研究

摘要

FOXM1(Forkhead box M1)是FOX转录因子家族中的一员，它有3种常见的亚型，分别是FOXM1a、FOXM1b、FOXM1c，目前研究最多的是FOXMb。FOXM1可以介导细胞周期相关下游基因的转录激活，在胚胎的发育、细胞分化、组织器官再生和恶性肿瘤的发展进程中行使着巨大的功能。据大量文献报道，FOXM1是人恶性肿瘤中最常见的高表达蛋白之一，与肿瘤的形成、不良预后、药物的敏感性及耐药性等密切相关。异常高表达的FOXM1促使下游基因的转录激活，会导致增殖异常、转移、迁移和侵袭等不良后果，影响肿瘤的形成进程。将FOXM1作为抗癌药物的作用靶标进行的开发及研究存在广阔的前景，是临床治疗的潜在策略。FOXM1作为诊断和治疗癌症的一种重要标志物也是各国科研人员的热门研究分子。　　细胞穿膜肽(Cell-Penetrating Peptides, CPPs)是一种富含碱性氨基酸的短肽，能够穿过天然的细胞膜屏障，进入细胞质甚至细胞核，并且不会破坏细胞的完整结构。细胞穿膜肽具有强大的运载功能，可以通过化学结合、基因融合等共价或非共价结合方式与多种大分子物质(如蛋白质、多肽、DNA、化学小分子药物、纳米颗粒、荧光素、腺病毒载体、脂质体及铁颗粒等)结合，甚至可以负载100KD以上的蛋白，并且对所穿膜的细胞没有损伤。其中研究最多的是来源于人类免疫缺陷病毒HIV的反式转录活化因子(Trans-activating transcriptional activator，TAT)，其47-57位氨基酸对跨膜转运起着至关重要的作用，它是一种天然来源的穿膜肽，生物相容性良好，可以在生物体内呈现出极佳的穿膜效率，具有良好的应用前景，已广泛运用于抗肿瘤药物开发中。　　本论文中，通过在hela细胞中共转FOXM1及其不同蛋白分段质粒，采用双荧光素酶报告基因实验筛选出对FOXM1转录活性具有抑制作用的分段：FOXM1688-748。为了确定其是否具有抗肿瘤作用，通过构建融合细胞穿膜肽TAT的pGEX-4T2-FOXM1688-748-TAT原核表达载体，使用原核表达系统和GST标签亲和纯化方法，制备得到带有GST标签并融合细胞穿膜肽TAT的重组蛋白。由于在GST标签和目的蛋白之间含有特异性的凝血酶识别位点，通过凝血酶酶切进一步得到无GST标签仅包含目的蛋白融合细胞穿膜肽TAT的重组蛋白：TAT-FOXM1688-748。直接运用重组蛋白TAT-FOXM1688-748处理不同种类的肿瘤细胞，发现其可以有效抑制细胞活力，同时对FOXM1的转录活性也具备抑制作用。这初步表明TAT-FOXM1688-748具有一定的抗肿瘤活性，有望成为治疗肿瘤的潜在药物。

目录

声明

第1章 绪论

1.1 转录因子FOXM1

1.2 癌症与治疗

1.3 GST重组蛋白表达系统简介

1.4 细胞穿膜肽TAT

1.5 本论文的研究背景与内容

第2章 CMV-Flag-GFP-FOXM1688-748抑制FOXM1转录活性

2.1 前言

2.2 实验材料

2.3 实验仪器

2.4 实验方法

2.4.1 细胞培养

2.4.2 质粒共转染实验

2.4.3 双荧光素酶报告基因实验

2.4.4 RNA提取、逆转录与RT-PCR检测

2.4.5 Western blotting

2.5.1 CMV-Flag-GFP-FOXM1688-748可以抑制FOXM1的转录活性

2.5.2 CMV-Flag-GFP-FOXM1688-748影响FOXM1下游靶基因的mRNA水平

2.5.3 CMV-Flag-GFP-FOXM1688-748会影响FOXM1下游靶基因的表达

2.6 小结

第3章 GST-FOXM1688-748-TAT重组蛋白的纯化及标签去除

3.1 前言

3.2 实验材料

3.3 实验仪器

3.4 实验方法

3.4.1 原核表达质粒pGEX-4T2-FOXM1688-748-TAT、pGEX-4T2-TAT的构建

3.4.2 DNA琼脂糖凝胶电泳

3.4.3 质粒小提

3.4.4 GST-tag重组蛋白的纯化与标签去除流程

3.4.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.4.6 双荧光素酶报告基因实验

3.5 实验结果

3.5.1 pGEX-4T2-FOXM1688-748-TAT、pGEX-4T2-TAT重组表达质粒的构建

3.5.2 GST-FOXM1688-748-TAT重组蛋白纯化与标签切除

3.5.3 TAT-FOXM1688-748可以抑制FOXM1的转录活性

3.6 小结

第4章 TAT-FOXM1-C(688-748)的抑瘤效应

4.1 前言

4.2 实验材料

4.3 实验仪器

4.4 实验方法

4.4.1 细胞培养

4.4.2 CCK8法检测细胞活力

4.4.3 细胞平板克隆形成实验

4.4.4 流式细胞仪检测细胞周期

4.4.5 细胞划痕检测细胞迁移

4.4.6 Western blotting

4.5.1 TAT-FOXM1688-748对不同类型肿瘤细胞的生长均具有一定的抑制效果

4.5.2 TAT-FOXM1688-748对231细胞平板克隆形成的影响

4.5.3 TAT-FOXM1688-748对细胞周期的影响

4.5.4 TAT-FOXM1688-748对细胞迁移的影响

4.5.5 TAT-FOXM1688-748对细胞蛋白表达水平的影响

4.6 小结

第5章 总结与展望

5.1 总结

5.2 展望

参考文献

附录A 英文缩写

附录B 常用缓冲溶液与试剂配方

附录C 攻读学位期间所发表的论文

致谢