β--葡萄糖苷酶最适温度、活性和产物耐受性的共定向进化

摘要

纤维素在地球上分布广泛，是一种可利用的天然高分子物质。β-葡萄糖苷酶（BGL）是纤维素水解过程中的关键限速酶。目前，BGL通过理性设计仍然无法同时提高产物耐受性与其活性。另外，酿酒酵母乙醇发酵温度与BGL最适温度差距较大。　　本研究以实验室自主筛选的草酸青霉16中的BGL为研究对象，从中提取总RNA，通过逆转录手段获得BGL的cDNA，再进行PCR扩增获得了去除信号肽的16BGL基因。以16BGL基因序列为模板，进行了一轮易错PCR，采用七叶苷与柠檬酸铁铵为底物的平板显色法，结合96孔板高通量筛选方法，再通过摇瓶进行复筛，最终，获得了目的突变体Y-1-B1。　　Y-1-B1的最适温度为50℃，比16BGL低了20℃。Y-1-B1的比活在40、45、50和80℃分别达到了213.3、405.6、505.3和151.7IU/mg，与16BGL相比，分别提高了70%、120%、80%和190%。Y-1-B1的催化效率常数kcat/Km达到了1354.94mM-1S-1，其产物抑制强度Kappm/KI值为1.13（当20mmol/L葡萄糖时），分别是16BGL的1.68倍和0.89倍（Y-1-B1葡萄糖的耐受性提高了12%），体现了更高的产物耐受性和活性。此外，在纤维素的同步糖化和发酵过程中额外添加Y-1-B1时，它的乙醇产量达到6.85g/L，比16BGL的乙醇产量提高了22%。模型构建及分子对接研究结果表明，Y-1-B1的突变位点为S414、V421和S441，这些突变位点远离活性位点口袋，因此推测这些改善的酶学性质与活性位点口袋无关，这提醒我们不要忽略远离催化中心的其他位点。　　总之，本研究通过一轮共定向进化，获得了产物耐受性、活性和最适温度同时改善的突变体，其在生物乙醇生产上具有潜在的应用价值。

目录

声明

第1章 绪论

1.1 木质纤维素

1.2 纤维素酶

1.3 BGL的简介

1.4 BGL的分子改造

1.5 高通量筛选

1.6 BGL在生物乙醇中的应用

1.7 本文的立题依据及研究内容

第2章BGL的共定向进化及其生物乙醇应用

2.1引言

2.2实验材料

2.3实验方法

2.4 实验结果

第3章BGL的生物信息学分析

3.1实验方法

3.2结果与分析

结论与展望

参考文献

附录

致谢

在读期间公开发表论文（著）及科研情况