具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的海绵共附生微生物及其活性产物研究

摘要

海绵共附生微生物是寻找和开发天然活性产物的重要来源之一，是研制糖尿病新型药物（α-葡萄糖苷酶抑制剂）的有效途径。
　　 本研究通过建立α-葡萄糖苷酶活性抑制剂筛选模型，对美国圣璜岛海域海绵的附生微生物发酵产物进行活性筛选。其中，α-葡萄糖苷酶活性测试体系是在96孔酶标板中进行，在α-葡萄糖苷酶浓度为0.008U/mL，pH值为6.8，反应温度37℃，测定产物波长为405nm的基础上，优化筛选模型。结果表明，模型的最佳筛选条件:底物PNPG浓度为10mmol/L、活性测试反应时间为25min，以及样品溶剂DMSO含量为2％ V/V。
　　 以α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖作为阳性对照样品，利用上述优化后的抑制活性筛选模型，对212株海绵微生物的粗提物样品进行筛选。结果表明:19株微生物的粗提物抑制率大于50％;其中，对于抑制活性最高的5株菌的粗提物，在浓度为0.4、0.6或0.8 mg/mL时，其抑制活性均在70％以上，远远高于阿卡波糖的最高抑制率58％(1.6mg/mL)。其中菌株HY936粗提物浓度在0.4mg/mL时，仍具有很高的α-葡萄糖苷酶抑制率79.3％。并对菌株HY936进行16S rDNA测序及分析，鉴定该菌株为坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）。
　　 本研究还对活性菌株Bacillus firmus的培养条件进行了优化。采用的单因素试验设计，以培养时间，摇床转速，接种量作为分析因素;正交试验验设计L9(34)，以蛋白胨、酵母膏、NaCl和pH值作为分析因素;从实验结果中确定适合菌株Bacillus firmus生长的最佳条件。然后，对菌株进行批量发酵，收集到粗提物2.8g，将其代谢产物通过硅胶薄层层析，高效分析液相等方法分离纯化。其中，硅胶柱粗分得到的组分Fr.1和Fr.4具有很高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，抑制率分别为35.5％、19.6％。对组分Fr.1作进一步的分离纯化，得到的组分Ⅱ对α-葡萄糖苷酶的抑制率达82.38％。通过GC-MS鉴定出组分Ⅱ中的11种化合物，主要成分是环二肽类和哌啶酮类物质，这为研制新型α-葡萄糖苷酶抑制剂提供了有力的线索，对这两类物质有待作进一步的研究。

目录

摘要

第1章 前言

1．1 海洋天然产物研究概况

1．1．1 海绵天然产物研究

1．1．2 海绵共附生微生物及其天然产物研究

1．2 α-葡萄糖苷酶与糖尿病

1．3 α-葡萄糖苷酶抑制剂

1．3．1 从天然动植物中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂

1．3．2 化学半合成的α-葡萄糖苷酶抑制剂

1．3．3 微生物由来的α-葡萄糖苷酶抑制剂

1．4 典型α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物

1．5 新型α-葡萄糖苷酶抑制剂及其应用

1．6 活性先导化合物活性筛选模型

1．7 选题意义和研究方案

第2章 α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型的建立

2．1 材料

2．1．1 主要仪器

2．1．2 主要试剂

2．2 方法

2．2．1 溶液的配制

2．2．2 筛选模型的建立及验证

2．3 结果与分析

2．3．1 α-葡萄糖苷酶活性测试体系

2．3．2 筛选模型的建立及验证

2．4 小结与讨论

第3章 具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的海绵共附生微生物的筛选和鉴定

3．1 材料

3．1．1 菌株

3．1．2 培养基

3．1．3 主要仪器

3．1．4 主要试剂

3．2 方法

3．2．1 海绵共附生微生物代谢产物的制备

3．2．2 α-葡萄糖苷酶抑制活性菌株的初步筛选

3．2．3 具α-葡萄糖苷酶抑制活性菌株的复筛

3．2．4 活性菌株的形态及扫描电镜分析

3．2．5 活性菌株的16S rDNA测序

3．3 结果与分析

3．3．1 海绵共附生微生物代谢产物的制备

3．3．2 具α-葡萄糖苷酶抑制活性菌株的初步筛选

3．3．3 具α-葡萄糖苷酶抑制活性菌株的复筛

3．3．4 菌株HY936的形态及扫描电镜分析

3．3．5 菌株HY936的16S rDNA测序及分析

3．4 小结与讨论

第4章 菌株Bacillus firmus的培养条件优化

4．1 材料

4．1．1 菌株

4．1．2 培养基

4．1．3 主要仪器

4．1．4 主要试剂

4．2 方法

4．2．1 Bacillus firmus的培养条件优化

4．2．2 利用正交试验优化培养基成分

4．3 结果与分析

4．3．1 Bacillus firmus的培养条件优化

4．3．2 利用正交试验优化培养基成分

4．4 小结与讨论

第5章 Bacillus firmus代谢产物中活性组分的分离与纯化

5．1 材料

5．1．1 菌株

5．1．2 培养基

5．1．3 主要仪器

5．1．4 主要试剂

5．2 方法

5．2．1 Bacillus firmus规模化发酵及α-葡萄糖苷酶活性测定

5．2．2 活性物质的柱层析分离

5．2．3 活性组分的GC-MS分析

5．3 结果与分析

5．3．1 Bacillus firmus规模化发酵及α-葡萄糖苷酶活性测定

5．3．2 硅胶柱分离及α-葡萄糖苷酶活性测定

5．3．3 活性物质的进一步分离纯化

5．3．4 活性组分的GC-MS分析

5．4 小结与讨论

第6章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

附录

附录一 阿卡波糖纯样品的HPLC分析报告

附录二 菌株HY936的16S rDNA测序结果

附录三 Bacillus firmus的培养条件优化

附录四 利用正交试验优化培养基成分

附录五 组分Fr.1的HPLC分析报告

附录六 组分Fr.4的HPLC分析报告

附录七 组分Fr.1的薄层层析分析

附录八 GC-MS分析报告

发表论文情况

致谢

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