霍山石斛多糖提取分离以及抗肿瘤活性的研究

摘要

霍山石斛是我国最早有记载的石斛类中药材,其药用价值为人们所共识.研究发现,多糖是霍山石斛中最主要的活性成分之一.本文以霍山石斛为研究对象,优化了霍山石斛多糖的提取工艺,纯化分离了多种多糖组分,重点研究了霍山石斛多糖对人胃腺癌细胞SGC-7901的抑制作用,探讨了多糖抗肿瘤作用与肿瘤相关基因之间的相关性. 通过单因素实验结合Box-Behnken设计和响应曲面分析,建立了提取温度、提取pH和提取时间与霍山石斛多糖提取率间的数学模型:Y=0.175767+0.023363X<,1>+0.013662X<,2>-0.032858X<,1>,<'2>+0.019X<,1>X<<2>-0.026308X<,2>,<'2>.霍山石斛多糖的最佳提取优化工艺条件为:提取温度69.4℃,时间1.57h,pH值5.9,料液比1:20,提取2次.在此条件下实际值与模型值的吻合度达到98.4﹪. 两种脱蛋白方法和五种脱色素方法的考察得出,Sevag法虽然比TCA法脱蛋白效果略差,但是对多糖总量保持较好,是较好的脱蛋白方法:DEAE-纤维素脱色法脱色率高,多糖损失率比较小,虽然DEAE一纤维素的价格较昂贵,但是其回收处理比较方便,是较佳的脱色方法. 水提获得的霍山石斛粗多糖HDP通过DEAE-纤维素离子交换色谱分离得到多糖HDP-1,HDP-2,HDP-3,HDP-4,HDP-5,HDP-6.其中抗胃癌活性最强的多糖HDP-2经Se:phacryl-200HR色谱后,又获得HDP-2-A和HDP-2-B两种多糖组分,经UV扫描不含蛋白. 多糖组份HDF-2对胃腺癌细胞SGC-7901的作用在荧光定量RT-PCR下检测得到,多糖组份HDP-2明显下调胃腺癌细胞SGC-7901中原癌基因c-myc的表达,仅为对照组表达率的42.34﹪.同时大幅提高肿瘤抑制基因野生型p53的表达,为对照组表达率的2.042倍.

目录

文摘

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致谢

一前言

1.1植物多糖的研究进展

1.1.1多糖的分类

1.1.2多糖的功能

1.1.3多糖的提取分离方法研究进展

1.2石斛属植物化学成分及药理活性

1.2.1石斛属植物化学成分

1.2.2石斛属植物药理活性

1.3霍山石斛研究进展

1.4论文研究的目的和意义

二材料与方法

2.1实验材料

2.2主要试剂

2.3主要仪器

2.4方法

2.4.1霍山石斛多糖提取分离工艺流程

2.4.2糖含量测定及标准曲线的建立

2.4.3影响霍山石斛多糖提取的关键工艺参数的单因素考察

2.4.4 Box-Behnken法中心组合实验设计

2.4.5两种脱蛋白方法的比较

2.4.6四种脱色方法的比较

2.4.7脱色率与多糖损失率的计算

2.4.8霍山石斛多糖的离子交换色谱

2.4.9霍山石斛多糖的凝胶渗透色谱纯化

2.4.10肿瘤细胞的培养

2.4.11 MTT法测细胞的生长曲线

2.4.12活性多糖的获取和灭菌

2.4.13多糖作用时间对抑瘤率的影响

2.4.14多糖浓度对抑瘤率的影响

2.4.15多糖抑瘤作用形态学检测

2.4.16多糖对SGC-7901细胞中p53，c-myc基因表达影响

三结果

3.1关键工艺参数对霍山石斛多糖提取的影响

3.2霍山石斛多糖提取工艺的优化

3.2.1 Box-Behnken试验结果

3.2.2回归方程拟合及方差分析

3.2.3最佳多糖提取工艺响应曲面分析结果

3.2.4多糖最佳提取工艺实验验证结果

3.3脱蛋白方法的确定

3.4脱色素方法的确定

3.5离子交换色谱分离

3.6多糖凝胶柱色谱分离

3.7 SGC-7901细胞生长曲线

3.8多糖作用时间对抑瘤率的影响

3.9多糖浓度对抑瘤率的影响

3.10多糖抑瘤作用形态学检测结果

3.11多糖作用下p53和c-myc基因表达结果

四讨论

4.1霍山石斛多糖提取的工艺优化

4.2霍山石斛多糖的除蛋白与脱色素方法的比较

4.3霍山石斛多糖的分离

4.4霍山石斛多糖的抗肿瘤作用

五结论与展望

5.1结论

5.2展望

参考文献