BARD1基因敲除与过表达对人真核细胞中Aurora--A、BRCA1与p53表达影响

目录

声明

前言

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

1.1.2 主要试剂及来源

1.1.3 主要仪器

1.2 方法

1.2.1 CRISPR/Cas9 技术敲除人 BARD1 基因质粒的构建

1.2.2 BARD1 基因过表达质粒提取与验证

1.2.3 细胞培养

1.2.4 细胞转染

1.2.5 BARD1 基因敲除与过表达 HEK293T 细胞系的构建

1.2.6 细胞总 RNA 提取

1.2.7 RNA 浓度测定

1.2.8 逆转录

1.2.9 实时荧光定量 PCR

1.2.10 MTT法

1.2.11 细胞总蛋白提取

1.2.12 总蛋白浓度测定

1.2.13 蛋白印迹实验（Western-blot)

1.3 溶液配制

1.3.1 PEI（支化聚乙烯亚胺）配制（工作浓度为 1mg/ml）

1.3.2 磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）配制

1.3.3 0.25% Trypsin 配制

1.3.4 SDS-PAGE 电泳缓冲液体

1.3.5 1×TBST Buffer 配制

1.3.6 封闭缓冲液（Western blot 杂交用）

1.4 BARD1 对 BRCA1、p53 与 Aurora-A 蛋白表达调控

1.5 统计方法

2.1 CRISPR/Cas9 技术敲除人 BARD1 基因三合一质粒的转化子验证

2.2 CRISPR/Cas9 技术敲除人 BARD1 因三合一质粒的测序结果

2.3 BARD1 敲除质粒电泳图

2.4 BARD1 过表达质粒酶切验证电泳

2.5 细胞培养及转染实验后荧光

2.6 BARD1、Aurora-A、p53及BRCA1表达鉴定

2.6.1 实时荧光定量 PCR 检测 BARD1、Aurora-A 及 BRCA1 mRNA 表达

2.6.2 扩增产物测序结果

2.6.3 Western blot 检测 BARD1、BRCA1、Aurora-A、p53 蛋白表达

2.7 细胞生长活性检测（MTT）

3.讨论

4. 结论

4.3 BARD1 基因敲除与过表达抑制了 HEK293T 细胞增殖，可能通过调控Aurora-A、p53 和 BRCA1 表达实现的

参考文献

文献综述:BARD1 蛋白的研究进展

参考文献

缩略语表

附录

攻读学位期间发表文章情况

个 人 简 历

致谢