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基于几丁质酶阻断的生物活性物质的筛选

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论文说明:图表目录

第一章 绪论

1.1 几丁质

1.2 几丁质酶

1.2.1 几丁质酶的分类

1.2.2 几丁质酶的性质

1.2.3 几丁质酶的分离纯化研究进展

1.2.4 几丁质酶的研究意义

1.3 几丁质酶抑制剂

1.3.1 几丁质酶抑制剂的应用

1.3.2 几丁质酶抑制剂的分类

1.3.3 几丁质酶抑制剂的作用机制

1.3.4 几丁质酶抑制剂的筛选模型

1.3.5 几丁质酶抑制剂的研究前景

1.4 本课题的研究意义

1.5 研究内容与思路

第二章 两种不同来源的几丁质酶的分离纯化及酶学性质的比较研究

2.1 引言

2.2 实验材料

2.2.1 昆虫及菌株

2.2.2 主要试剂和仪器

2.3 实验方法

2.3.1 胶体几丁质的配置

2.3.2 几丁质酶酶活力的测定

2.3.3 几丁质酶的分离纯化

2.3.4 蛋白质含量测定

2.3.5 SDS-PAGE分析

2.3.6 两种不同来源的几丁质酶酶学性质的比较研究

2.4 结果与分析

2.4.1 氨基葡萄糖标准曲线

2.4.2 几丁质酶的分离纯化

2.4.3 两种不同来源的几丁质酶酶学性质的比较研究

2.5 本章小结

第三章 基于几丁质酶阻断的筛选模型的建立及微生物的筛选

3.1 引言

3.2 实验材料

3.2.1 实验材料

3.2.2 主要试剂和仪器

3.3 实验方法

3.3.1 土样采集

3.3.2 菌株的分离纯化-梯度稀释平板划线法

3.3.3 活性菌株的液体培养方法

3.3.4 活性菌株的初筛—平板透明圈法

3.3.5 活性菌株的复筛—DNS比色法

3.4 结果与分析

3.4.1 土壤中菌株的分离纯化结果

3.4.2 活性菌株的筛选

3.5 本章小结

第四章 活性物质纯化路线初探

4.1 引言

4.2 实验材料

4.2.1 菌株及酶液

4.2.2 主要试剂和仪器

4.3 实验方法

4.3.1 发酵液的预处理

4.3.2 DNS法活性跟踪检测

4.3.3 萃取相活性物质分离方法

4.3.4 萃余相活性物质分离方法——硫酸铵盐析

4.3.5 醇沉相活性物质处理方法——Sevage试剂除蛋白

4.4 结果与分析

4.4.1 活性物质纯化第一步初探

4.4.2 B11-24活性物质分离条件的摸索

4.4.3 B2-9活性物质分离条件的摸索

4.5 本章小结

第五章 活性菌株A0901#活性代谢产物的分离纯化

5.1 引言

5.2 实验材料

5.2.1 菌株和酶液

5.2.2 主要试剂和仪器

5.3 实验方法

5.3.1 菌株A0901#产活性物质的制备

5.3.2 紫外分光光度法鉴定纯度

5.3.3 薄层检测

5.3.4 活性物质的初步鉴定

5.3.5 活性物质的理化性质

5.4 结果与分析

5.4.1 活性菌株A0901#活性代谢产物的分离纯化

5.4.2 紫外分光光度法鉴定纯度

5.4.3 显色剂检测

5.4.4 活性物质的初步鉴定

5.4.5 活性物质的理化性质

5.5 本章小结

第六章 活性菌株A0901的菌株鉴定及其发酵条件的初步研究

6.1 引言

6.2 实验材料

6.2.1 材料

6.2.2 主要试剂和仪器

6.3 实验方法

6.3.1 形态和培养特征观察

6.3.2 分子生物学鉴定

6.3.3 A0901培养方法

6.3.4 发酵条件的优化

6.4 结果与分析

6.4.1 菌株A090l的形态观察

6.4.2 菌株A0901的分子鉴定

6.4.3 发酵条件的优化

6.5 本章小结

第七章 结论与展望

7.1 结论

7.2 展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

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摘要

几丁质酶在真菌和昆虫的生理和发育过程中起着关键作用,该酶本身及其酶抑制剂是获取生物农药的重要途径。
   论文首先分别从蚕蛹和棉铃虫蛹体内提取几丁质粗酶,经过硫酸铵分级沉淀和Sephadex G-150分离得到几丁质酶。用SDS-PAGE测得两酶的分子量分别为88kDa、75kDa;水解胶体几丁质的Km值分别为22.3μmol/L、41.0μmol/L;酶反应的最适温度分别为45℃和50℃,最适pH值均为6.0;高浓度的Mn2+对两酶均有较强的激活作用,而Cu2+、SDS对两酶都有较强的抑制作用;两酶对所选用的真菌均有抑制作用。
   以棉铃虫蛹几丁质酶作为筛选靶标,通过平板透明圈法和DNS比色法进行几丁质酶抑制剂的筛选,从全国各地共34份土样中筛选出以A0901#菌株为代表的具有几丁质酶抑制性的活性菌株33株。
   对33株活性菌株发酵液中的活性物质成分的分离纯化技术进行初步探索,比较系统地研究了A0901#菌株活性物质的分离纯化。采用活性追踪的方法对其进行分离,通过乙醇沉淀、Sevage试剂除蛋白及Sephadex G-100凝胶色谱得到一个纯的活性物质,经HPLC检测显示在保留时间15min左右为一单峰,DNS比色法验证其抑制率为54.2%,红外、质谱、元素分析确定其为一个多羟基的化合物。
   经形态、培养特征以及16S rDNA序列聚类分析,将菌株A0901#鉴定为链霉菌属。并确定其发酵条件为:可溶性淀粉作为碳源,KNO3作为氮源,发酵培养基初始pH值调至6.0,最适温度28℃,接种量为10%,培养时间6d,发酵液抑制效果最佳。

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