基于同步辐射软X射线诱变的产L-乳酸米根霉育种研究

摘要

L－乳酸是广泛应用于食品、医药等行业的重要有机酸，以其为原料制备的聚L－乳酸是一种生物相容性优良的新型可生物降解材料。米根霉发酵生产L－乳酸具有营养要求简单、产L－乳酸光学纯度高等优点。但目前用于发酵产L－乳酸的米根霉菌种普遍存在发酵强度低、发酵性能差等问题。辐射诱变是微生物菌种获得稳定、优良性状的重要方法，而同步辐射软X射线覆盖了生命分子重要组成元素的碳、氮、氧的k吸收边波长，具有很好的生物学效应，是一种具有开发应用前景的微生物辐射诱变源。
　　本文基于同步辐射软X射线诱变，依据米根霉产L－乳酸的代谢控制原理，以提高L－乳酸产量、增大发酵强度、改善发酵条件适应性为目标，针对米根霉的诱变方法与定向选育技术开展研究，采用代谢分析、基因突变检测、蛋白质组表达量差异分析等技术对其突变的机理进行探讨，主要研究结论如下：
　　(1)在中国科技大学国家同步辐射实验室的软X射线辐照装置上，通过考察孢子吸附固定载体的材料、样品架载样量等因素，确定了适合米根霉同步辐射软X射线辐照的条件。研究获得米根霉孢子在Ck(4.4 nm)、Nk(3.02 nm)、Ok(2.3 nm)波长软X射线辐照条件下的致死剂量曲线，并通过致死效应、能量沉积效应分析，选择Nk波长软X射线为米根霉主要的辐射诱变源。以乙醇脱氢酶(ADH)活力弱化突变率为指标，通过分析致死率与正突变率的关系，确定了同步辐射软X射线Nk辐射诱变米根霉突变最适剂量范围为0.4kGy-0.8kGy。
　　(2)以AS3.819为出发株，经同步辐射软X射线诱变选育获得ADH弱化突变株ADH-21。突变株的L－乳酸产量为94.01g/L，比出发株的L－乳酸产量82.49 g/L提高了13.97%，而乙醇生产量较出发株降低了70.99%。突变株的乳酸脱氢酶(LDH)活力较出发株提高了34.7%，而ADH活性比出发株的降低了79.85%。可见下调ADH活性是减少米根霉副产物乙醇生成量，增加L－乳酸产量的有效方法。经分离、纯化得到出发株与突变株的ADH，发现pH值及[Zn2+]、[Mg2+]对二者的ADH活性影响规律基本相同，但突变株的ADH最适反应温度更低，会导致突变株ADH活力下降。另外，通过对出发株与突变株ADH基因的cDNA测序、分析，获得比对结果。
　　(3)利用弱化氧化磷酸化过程降低胞内能荷水平对糖酵解影响的调控机理，以AS3.819为出发株，经同步辐射软X射线诱变选育获得F0F1-ATPase活力明显降低、胞内能荷下降了29.5%的突变株F0F1-17。突变株的糖酵解途径关键酶磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸甘油醛脱氢酶(GADPH)的活性分别比出发株增加了58.5%，24.8%和19.8%。突变株的葡萄糖消耗速率、平均比消耗速率(qs)、L-乳酸发酵强度及平均比生成速率(qp)较出发株分别提高17.5%，85.9%，24.1%及61.5%。突变株的最高产量达到91.54g/L，发酵周期较出发株缩短了约6h。说明胞内的能荷状态降低，糖酵解途径关键酶活性增强，导致米根霉发酵产L-乳酸的发酵性能提高。
　　(4)利用Mg2+激活己糖激酶(HK)，研究[Mg2+]上调对F0F1-17及AS3.819的发酵性能影响。表明在Mg2+调节作用下，HK活性的微幅增加可导致米根霉菌株产L-乳酸发酵过程的发酵性能微幅增强，这种增强的幅度在F0F1-ATP合酶(F0F1-ATPase)活力弱化突变株中表现更明显。由此，以米根霉F0F1-17为出发株，经同步辐射软X射线诱变选育获得HK活力增加85.3%突变株HK-3。与出发株及AS3.819相比，HK-3的葡萄糖消耗速率、葡萄糖的平均比消耗速率分别增加了29.8%、141.4%及27.9%、50.3%。HK-3发酵L-乳酸产量达到97.53g/L，其发酵强度及产物平均比生成速率qp分别比出发株F0F1-17增加41%和71.8%、比AS3.819分别增加75%和177.5%。说明降低F0F1-ATPase活性、提高HK活性，米根霉菌株能获得较好的发酵性能。
　　(5)为提高米根霉在酸性环境中的发酵性能，以AS3.819为出发株，经同步辐射软X射线诱变选育获得耐酸突变株acid-18。中和剂碳酸钙添加量为30g/L时，突变株的L-乳酸产量为83.5g/L，比出发株提高26.53%，其LDH比出发株提高42.2%。另外，突变株的质膜H+-ATPase酶活高于出发株的原因可能与突变株耐酸性增强相关。通过二维双向电泳分离、PDQuest软件分析，发现耐酸突变株与出发株蛋白质组表达量差异点有475个，其中丰度差异显著的12个点，并确定这12个蛋白的分子量和等电点。经质谱分析、数据库检索鉴定出其中的5个蛋白。
　　本文利用同步辐射软X射线对真菌米根霉诱变进行了首次有益探索，在建立米根霉的软X射线诱变条件的基础上，研究通过ADH活力弱化、F0F1-ATPase活力弱化与HK活力增强、菌株耐酸性增强等途径提高L-乳酸发酵强度、改善发酵性能方法，综合分析突变株在代谢物、代谢关键酶、蛋白质组及cDNA水平的突变效应。研究结果为良好发酵性能的米根霉工业菌株选育提供了基础研究数据。

目录

文摘

英文文摘

致谢

图目录

表目录

缩写词对照表

第一章 绪 论

1.1 L-乳酸简介

1.1.1 L-乳酸的结构与性质

1.1.2 L-乳酸的应用

1.1.3 乳酸的生产方法

1.1.4 发酵法生产L-乳酸菌种类型

1.1.5 根霉与细菌发酵生产L-乳酸的比较

1.2 米根霉产L-乳酸育种研究现状

1.2.1 米根霉产L-乳酸的经典诱变育种研究

1.2.2 米根霉产L-乳酸的代谢控制诱变育种研究

1.2.3 米根霉产L-乳酸的基因工程与代谢工程育种研究

1.3 同步辐射软X射线诱变

1.3.1 电磁辐射诱变

1.3.2 同步辐射软X射线诱变

1.4 本文主要研究内容

1.5 研究的课题来源

1.6 本论文的技术研究框架图

参考文献

第二章 米根霉同步辐射软X射线诱变方法的建立

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 试验方法

2.2.3 数据处理方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 米根霉孢子同步辐射软X射线辐照实验条件的建立

2.3.2 同步辐射软X射线Ck、Nk、0k辐射剂量对米根霉的致死及能量沉积效应

2.3.3 同步辐射软X射线诱变米根霉的最适辐射剂量条件的确定

2.4 本章小结

参考文献

第三章 米根霉乙醇脱氢酶活力弱化突变株的选育

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2 试验方法

3.2.3 检测方法

3.2.4 数据处理方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 ADH活力弱化突变株的筛选及最优突变株的选择

3.3.2 突变株与出发株发酵特性的比较

3.3.3 出发株与突变株乙醇脱氢酶的分离纯化及性质比较

3.3.4 乙醇脱氢酶突变株碱基突变机理的初步分析

3.4 本章小结

参考文献

第四章 米根霉F0F1-ATP合酶活力弱化突变株的选育

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.2 试验方法

4.2.3 检测方法

4.2.4 数据处理方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 F0F1-ATPase活力弱化型突变株的选育

4.3.2 突变株与出发株种子培养特性比较

4.3.3 突变株与出发株的发酵特性比较

4.3.3 L-乳酸合成过程中关键酶活性的变化

4.4 本章小结

参考文献

第五章 米根霉己糖激酶活力增强突变株的选育

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 材料

5.2.2 试验方法

5.2.3 检测方法

5.2.4 数据处理方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 [Mg2+]对米根霉AS3.819及FOF1-17菌株L-乳酸发酵特性的影响

5.3.2 HK活性增强突变株的选育及发酵特性

5.4 本章小结

参考文献

第六章 米根霉耐酸性突变株的选育

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.2.1 材料

6.2.2 试验方法

6.2.3 检测方法

6.2.4 数据处理方法

6.3 结果与讨论

6.3.1 L-乳酸平板上的突变株与AP平板上的突变株的菌落形态比较

6.3.2 突变株的驯化和复筛

6.3.3 突变株与出发株发酵特性的研究与比较

6.3.4 米根霉耐酸性突变株与出发株蛋白质组表达量差异

6.3 本章小结

参考文献

第七章 结论与展望

7.1 结论

7.2 论文的创新点

7.3 展望

攻读博士学位期间发表的论文