口服心肌细胞培养液冻干物对人鼻咽癌裸鼠移植瘤生长抑制的实验研究

摘要

目的:比较不同浓度的心肌细胞培养液(cardicac muscle cell culturemedium，CMCM)对鼻咽癌CNE-2细胞的增殖活性的影响，初步确定CMCM体外抑瘤效应的有效浓度。通过初步研究CMCM对鼻咽癌CNE-2细胞的体外迁移能力的影响，为其对肿瘤细胞体内迁移能力影响的后期实验研究提供实验基础。初步观察口服CMCM冻干物对人鼻咽癌裸鼠移植瘤的生长、凋亡以及对裸鼠体重的影响，分析口服给药方式的可行性和有效性，以及可能的不良反应，为将来CMCM冻干物的口服给药途径在恶性肿瘤治疗的临床应用中提供科学的理论依据。　　方法:1、采用双酶消化法原代培养Wistar乳鼠的心肌细胞，并收集对数生长期的细胞上清液，即Wistar乳鼠的CMCM。用截留分子量为10KD的超滤离心管以4000转/分超低温离心10min，收集分子量小于10KD的滤液。用直径为0.22μm的滤菌器过滤除菌后冷冻干燥成干粉，-20℃保存备用。2、采用MTT法观察不同浓度的CMCM对鼻咽癌CNE-2细胞的增殖活性的影响，找出其有效的抑瘤浓度;然后利用MTT法确定的有效抑瘤浓度进行划痕实验，24h后观察CMCM对鼻咽癌CNE-2细胞的体外迁移能力的影响。3、采用细胞悬液接种法建立人鼻咽癌CNE-2细胞的BALB/C裸鼠移植瘤模型。当瘤体积平均值达100mm3左右时，将42只荷瘤裸鼠随机分为7组:腹腔阴性对照组（25ml/kg生理盐水;normal saline，NS）、腹腔CMCM组（15mg/kg的CMCM溶于25ml/kg的NS中）、腹腔阳性对照组(2mg/kg的顺铂溶于25ml/kg的NS中;cisplatin，DDP）、灌胃阴性对照组（25ml/kg的NS）、灌胃CMCM低剂量组（30mg/kg的CMCM冻干物溶于25ml/kg的NS中）、灌胃CMCM中剂量组（60mg/kg的CMCM冻干物溶于25ml/kg的NS中）和灌胃CMCM高剂量组（120mg/kg的CMCM冻干物溶于25ml/kg的NS中），每组6只，同时根据分组要求开始给药。各组裸鼠采用每天灌胃给药的方式给予一次相应浓度的CMCM或NS，共14天。给药期间每3天测一次裸鼠体重和肿瘤体积。停药24小时后处死裸鼠，迅速将鼻咽癌CNE-2细胞的移植瘤分离并称瘤重，计算抑瘤率。采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyltransferase mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)检测移植瘤组织中的细胞凋亡情况，Ki67免疫组化染色法检测瘤组织中肿瘤细胞的增殖情况。　　结果:1、MTT结果显示:作用鼻咽癌CNE-2细胞48h后，1∶4稀释的心肌细胞培养液(1/4CMCM)、1∶8稀释的心肌细胞培养液(1/8CMCM)和1∶16稀释的心肌细胞培养液(1/16CMCM)对鼻咽癌CNE-2细胞的存活率与阴性对照组比较有增加的趋势(P＜0.05)，而1∶2稀释的心肌细胞培养液(1/2CMCM)组和心肌细胞培养液原液(i/1CMCM)组中鼻咽癌CNE-2细胞的存活率与阴性对照组比较有降低的趋势(P＜0.05)，表明一定浓度的CMCM可以在体外抑制鼻咽癌CNE-2细胞的增殖。2、划痕实验结果显示:作用鼻咽癌CNE-2细胞24h后，1/1CMCM和1/2CMCM组与阴性组相比，细胞迁移距离更短，迁移速度更缓慢(P＜0.05)。但是，这两组间的细胞迁移距离比较无明显统计学差异（P＞0.05），表明一定浓度的CMCM可以体外抑制鼻咽癌CNE-2细胞的迁移。3、虽然在给药后的实验观察期间，各组人鼻咽癌CNE-2细胞的裸鼠移植瘤的肿瘤体积均出现逐渐增加的趋势，但是在给药后的第3天开始，腹腔CMCM组（15mg/kg）、腹腔阳性对照组(DDP2mg/kg)、灌胃CMCM低剂量组(30mg/kg)、灌胃CMCM中剂量组(60mg/kg和灌胃CMCM高剂量组(120mg/kg)中的瘤体积与腹腔阴性对照组或灌胃阴性对照组相比，肿瘤体积增长速度就已经明显减慢(P＜0.05)，而对等同剂量下的腹腔CMCM组(15mg/kg)与灌胃CMCM中剂量组（60mg/kg）的瘤体积进行比较发现，在第3天、12天和15天存在统计学差异(P＜0.05)。4、停药后，处死裸鼠，称取各组移植瘤的瘤重，发现与腹腔阴性对照组或灌胃阴性对照组的瘤重相比，腹腔CMCM组(15mg/kg)、腹腔阳性对照组（DDP2mg/kg）、灌胃CMCM低剂量组（30mg/kg）、灌胃CMCM中剂量组（60mg/kg）和灌胃CMCM高剂量组(120mg/kg)的瘤重较轻。且对等同剂量下的腹腔CMCM组（15mg/kg）与灌胃CMCM中剂量组(60mg/kg)的瘤重进行比较发现，灌胃CMCM中剂量组（60mg/kg）的肿瘤组织重量明显减轻(P＜0.05)，但抑瘤率无明显的统计学差异(P＞0.05)。这些结果表明，口服CMCM冻干物可以抑制人鼻咽癌CNE-2裸鼠移植瘤的生长。5、在实验观察期间，各组裸鼠的体重均有所增加，只有腹腔阳性对照组(DDP2mg/kg)的体重增加不明显，与腹腔阴性对照组相比，存在统计学差异(P＜0.05)，其余各小组之间的裸鼠体重之间无统计学差异(P＞0.05)，表明口服CMCM各剂量组的冻干物对移植了人鼻咽癌CNE-2细胞的裸鼠体重增长无影响，其可能是一种具有生物安全性的抗肿瘤物质。6、Ki67免疫组化的结果显示:腹腔阴性对照组的Ki67阳性细胞百分率为71.38±1.21％，腹腔CMCM组(15mg/kg)和腹腔阳性对照组（DDP2mg/kg）的Ki67阳性细胞百分率分别为48.86±2.13％、25.55±3.2％。与腹腔阴性对照组相比，其余腹腔各组的Ki67表达率均降低（P＜0.05）。而灌胃阴性对照组的Ki67阳性细胞百分率为75.70±7.17％，灌胃CMCM低剂量组（30mg/kg）、灌胃CMCM中剂量组（60mg/kg）和灌胃CMCM高剂量组(120mg/kg)的Ki67阳性细胞百分率分别为60.65±4.23％、51.04±4.58％、41.42±8.24％。与灌胃阴性对照组相比，灌胃CMCM各剂量组的Ki67表达率均降低（P＜0.05），且将CMCM各剂量组之间进行差异比较，发现Ki67阳性细胞百分率有随剂量的增加而降低的趋势（P＜0.05）。表明口服心肌细胞培养液冻干物可以在体内抑制人鼻咽癌CNE-2细胞的增殖作用。但是，对等同剂量下的腹腔CMCM组(15mg/kg)与灌胃CMCM中剂量组（60mg/kg）的Ki67阳性细胞百分率进行比较发现，两者之间没有明显的统计学差异（P＞0.05）。7、TUNEL结果显示:腹腔阴性对照组的细胞凋亡百分率为17.67±6.22％，腹腔CMCM组(15mg/kg)和腹腔阳性对照组(DDP2mg/kg)的细胞凋亡百分率分别为42.01±6.74％、70.7±6.32％，与腹腔阴性对照组相比，其余各组的凋亡细胞数均增加(P＜0.05)。而灌胃阴性对照组的细胞凋亡百分率为18.63±3.59％，灌胃CMCM低剂量组（30mg/kg）、灌胃CMCM中剂量组(60mg/kg)和灌胃CMCM高剂量组（120mg/kg）的细胞凋亡百分率分别为30.23±6.02％、51.63±11.09％、60.61±8.71％，与灌胃阴性对照组相比，灌胃CMCM各剂量组的凋亡细胞数均增加(P＜0.05)。表明口服CMCM冻干物可以促进人鼻咽癌CNE-2裸鼠移植瘤的细胞凋亡作用。但是，对等同剂量下的腹腔CMCM组(15mg/kg)与灌胃CMCM中剂量组(60mg/kg)的细胞凋亡百分率进行比较发现，两者之间没有明显的统计学差异(P＞0.05)。　　结论:1、心肌细胞培养液可以体外抑制鼻咽癌CNE-2细胞的增殖和迁移。2、心肌细胞培养液可能是一种安全有效的天然抑瘤物，通过口服其冻干物可表现出良好的抗肿瘤作用。3、口服心肌细胞培养液冻干物可以抑制人鼻咽癌CNE-2细胞的裸鼠移植瘤的生长，其抗肿瘤机制可能与抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡相关。

目录

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 主要实验试剂

3 主要实验仪器

4 实验方法

5 统计分析

结果

1 不同浓度的心肌细胞培养液(CMCM)对鼻咽癌CNE-2细胞存活率的影响

2 不同浓度的心肌细胞培养液(CMCM)对鼻咽癌CNE-2细胞的迁移能力的影响

3 口服心肌细胞培养液(CMCM)冻干物对人鼻咽癌裸鼠移植瘤的影响

4 口服心肌细胞培养液(CMCM)冻干物对人鼻咽癌CNE-2裸鼠移植瘤中Ki67表达的影响

5 口服心肌细胞培养液(CMCM)冻干物对人鼻咽癌CNE-2裸鼠移植瘤细胞凋亡的影响

讨论

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

心房利钠肽原不同肽段的抗肿瘤机制

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