竹笋残渣中植物甾醇的抽取及发酵工艺研究

摘要

我国是竹笋出口大国,年产量为320万吨以上,居世界之首。竹笋残渣是在竹笋加工过程中丢弃的剩余物,占竹笋的50～70％,若不加以合理利用,既是有效资源的极大浪费,又对环境造成了污染,影响生态平衡。因此,将竹笋残渣进行深加工,充分开发微生物资源,利用微生物发酵竹笋残渣制取植物甾醇,即是重要的环保措施,又能提高竹笋加工业的经济效益,是一个很好的研究思路。　　 为此,本研究以重庆方竹笋残渣为原料,通过从腐烂竹笋残渣中分离得到9种菌种,并筛选出产植物甾醇能力最强的黑曲霉。在将该黑曲霉经驯化和单因素的基础上,通过二次正交选择组合实验,得到了最佳发酵产植物甾醇工艺条件。在此基础上,通过比较分析5种不同的提取方法所得植物甾醇含量,得到最佳提取方法。主要结果如下:　　 1.研究了Liebermann-Burchard比色法和高效液相色谱法(HPLC)测定植物甾醇;通过优化比色法测定竹笋总甾醇:反应24min后,于波长610nm处测定吸光度效果最佳。通过建立HPLC法检测分析竹笋主要甾醇类化合物:发现在采用Ultimate XB-C18色谱柱,流动相选择甲醇:乙腈=35:65、波长选择200nm、柱温:28℃、流速1.0mL/min条件下检测效果最佳。　　 2.通过设计8组竹笋残渣堆积方式进行腐烂,从中选出最佳菌种源,并对其进行分类传代培养,经特异性琼脂培养基多次平板分离后,得到9种菌种,从中筛选出产植物甾醇能力最强的菌种,经鉴定该菌种为黑曲霉。　　 3.对分离得到的高产植物甾醇黑曲霉进行了发酵工艺优化。研究结果表明,黑曲霉经驯化3次,发酵方式为固态好养、菌种接种量4.2mL/100g.发酵时间5.3天、发酵温度33.3℃、氮源为尿素、氮源添加量4.1％的条件下获得最佳发酵效果,此时发酵样品的总甾醇含量为1168±32.4mg/100g。　　 4.采用索式提取法、细胞粉碎法、回流法、超声辅助法及传统溶剂浸提法对发酵前后的样品进行提取。通过测定各提取工艺所得的总甾醇含量并比较其提取率,结果表明索式提取法>超声细胞粉碎法>回流法>超声辅助法>传统溶剂浸提法,再结合实际提取过程中因考虑的能耗大小、环境问题、操作难易等因素,最终选择超声细胞粉碎法做为最佳提取工艺。　　 5.以发酵前的竹笋残渣为原料,总甾醇及β-谷甾醇提取率为考察指标,对超声细胞粉碎提取工艺进行优化。研究结果表明,在料液比1:31、超声功率410w、超声时间10.5 min、颗粒粒径86目的条件下获得最佳提取效果,此时总甾醇提取率为85.6％β-谷甾醇提取率为86.8％。

目录

声明

摘要

第1章 前言

1.1 课题的研究意义

1.2 我国竹笋及残渣的研究现状

1.2.1 竹笋残渣制备膳食纤维的研究

1.2.2 竹笋残渣提取过氧化酶的研究

1.2.3 竹笋残渣提取酪氨酸的研究

1.2.4 竹笋残渣开发饮料的研究

1.2.5 竹笋残渣在饲料中的研究

1.2.6 竹笋残渣中次生代谢产物的研究

1.3 植物甾醇

1.3.1 植物甾醇的结构、存在形式、来源及理化性质

1.3.2 植物甾醇的提取和精制

1.3.3 植物甾醇的分析方法

1.3.4 植物甾醇的生物学功能

1.4 菌种筛选及分离纯化的概述

1.4.1 微生物资源的收集

1.4.2 微生物菌种的分类富集培养

1.4.3 微生物菌种的筛选

1.4.4 微生物菌种的分离纯化

1.4.5 微生物菌种的驯化

1.5 本课题的研究思路及内容

第2章 竹笋残渣中植物甾醇类化合物检测方法的建立

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 主要试剂

2.2.3 主要设备仪器

2.2.4 水分含量测定方法

2.2.5 实验方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 比色法测定竹笋加工剩余物及提取物中的总甾醇含量

2.3.2 HPLC法检测竹笋残渣及提取物中的主要甾醇类化合物及其含量

2.3.3 比色法、HPLC法评价方竹笋不同部位对甾醇含量的影响

2.4 本章小结

第3章 发酵方竹笋残渣高产植物甾醇的菌种分离及鉴定

3.1 前言

3.2 实验材料

3.2.1 原材料

3.2.2 主要试剂

3.2.3 主要仪器设备

3.2.4 培养基及试液

3.2.5 总甾醇提取及测定方法

3.2.6 实验室已有菌种

3.2.7 野生菌种源的选择

3.2.8 菌种的培养及筛选

3.2.9 最佳菌种的确定及鉴定

3.2.10 最佳菌种的扩大培养及保存

3.3 结果与讨论

3.3.1 菌种源的选择

3.3.2 菌种的分类、传代培养

3.3.3 野生菌种平板分离的结果

3.3.4 优良菌种的确定

3.3.5 最佳菌种的确定及鉴定

3.4 小结

第4章 高产植物甾醇微生物发酵工艺的优化

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 实验材料

4.2.2 主要试剂

4.2.3 主要仪器设备

4.2.4 试验及分析方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 菌种驯化次数的选择

4.3.2 单因素分析

4.3.3 二次正交旋转试验结果的分析统计

4.4 本章小结

第5章 不同提取方法的比较分析

5.1 材料与方法

5.1.1 实验材料

5.1.2 主要试剂

5.1.3 主要仪器设备

5.1.4 实验与方法

5.2 结果与讨论

5.2.1 比色法、HPLC法分析索式提取法所得植物甾醇

5.2.2 比色法、HPLC法分析超声细胞粉碎法所得植物甾醇

5.2.3 比色法、HPLC法分析回流法所得植物甾醇

5.2.4 比色法、HPLC法分析超声辅助法所得植物甾醇

5.2.5 比色法、HPLC法分析传统溶剂浸提法所得植物甾醇

5.2.6 不同提取方法的比较分析

5.2.7 最佳提取方法的选择

5.3 本章小结

第6章 响应面法优化竹笋剩余物甾醇的超声粉碎提取工艺

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.2.1 实验原材料

6.2.2 主要试剂

6.2.3 主要仪器设备

6.2.4 实验方法

6.3 结果与讨论

6.3.1 单因素实验分析

6.3.2 Box-Behnken试验方案及结果的统计分析

6.3.3 提取次数对植物甾醇提取率的影响

6.4 本章小结

结论与建议

参考文献

致谢

附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录