基因工程改造小球藻提高其虾青素表达量

摘要

虾青素是一种次生类胡萝卜素，具有超强的抗氧化性，在生物体内能淬灭单线态氧、清除自由基，可以防止机体衰老，增强免疫力。同时还具有抗癌抑癌、预防心血管疾病等生物学功能，广泛应用于食品、医药和保健品等行业。小球藻含有虾青素，具有生长速度快、生物密度高、易培养等优点，是很好的生物反应器。但是小球藻中虾青素含量低，应用基因工程的方法提高虾青素含量成为近年来研究的热点。
　　农杆菌具有操作简单、转化效率高、经济实用等优点，近年来广泛应用于藻类的遗传转化。本研究建立农杆菌介导的小球藻遗传转化的方法，构建β-胡萝卜素酮化酶基因表达载体，并通过农杆菌介导的方法转入小球藻中，提高虾青素含量。本论文具体研究内容和成果如下:
　　1、筛选体系的确定:研究羧苄青霉素对农杆菌和小球藻的影响，羧苄青霉素浓度为200mg/L时抑制农杆菌的生长，羧苄青霉素对小球藻生长无影响。研究小球藻在BBM液体培养基和固体培养基中对G418的敏感性，确定在BBM液体培养中G418的筛选浓度为1mg/L;在BBM固体培养基中G418的筛选浓度为2mg/L。最终确定BBM液体培养基中G418浓度为1mg/L和羧苄青霉素浓度为500mg/L的小球藻筛选体系;在固体培养基中G418浓度为2mg几和羧苄青霉素浓度为500mg/L的小球藻筛选体系。
　　2、以GFP为报告基因，以G418抗性基因（NPTⅡ）作为筛选标记基因，CaMV35S为启动子，PBI121为载体，利用农杆菌介导转化的方法，建立小球藻遗传转化体系。通过PCR验证，GFP基因在小球藻内完成基因重组;通过RT-PCR验证，GFP基因成功转录;在激光共聚焦下转化子显示绿色荧光，GFP基因成功翻译。转化200天后，阳性鉴定依然为阳性，GFP稳定遗传表达。
　　3、构建PBI121∷35S∷PDSSP-BKT载体。PDSSP为调控八氢番茄红素的信号肽基因，BKT为β-胡萝卜素酮化酶基因，先通过overlap PCR技术克隆获得PDSSP-BKT融合基因。
　　4、利用农杆菌介导转化的方法，将PDSSP-BKT融合基因转入小球藻，并筛选阳性转化子，提取虾青素，通过HPLC测定，在相同培养条件下，转化子中虾青素含量比野生型高63.5％。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1 虾青素简介

1．1 虾青素的结构与特征

1．2 虾青素的功能和应用

1．3 虾青素的来源

2 小球藻简介

2．1 小球藻的分类

2．2 小球藻的生理特征

2．3 小球藻的应用

3 小球藻合成虾青素

3．1 小球藻合成虾青素的代谢途径

3．2 小球藻合成虾青素相关酶及编码基因

4 小球藻基因工程的研究进展

4．1 筛选标记基因

4．2 启动子

4．3 小球藻的遗传转化方法

5 研究目的、意义和内容

5．1 研究目的及意义

5．2 研究内容

第二章 小球藻遗传转化体系的建立

1 引言

2 材料与仪器

2．1 藻种与菌种

2．2 实验仪器

2．3 实验试剂

2．4 常用培养基及试剂的配制

3 实验方法

3．1 小球藻的培养方法

3．2 农杆菌介导小球藻筛选体系的建立

3．3 小球藻的侵染转化

3．4 小球藻转化子的筛选

3．5 小球藻DNA提取方法

3．6 小球藻RNA提取方法

3．7 小球藻阳性鉴定

3．8 电泳

3．9 荧光测定

4 结果与讨论

4．1 羧苄青霉素对小球藻和农杆菌的影响

4．2 G418对小球藻的影响

4．3 小球藻阳性鉴定

4．4 荧光检测

5 本章小结

第三章 PDSSP-BKT融合基因提高小球藻表达虾青素

1 引言

2 材料与仪器

2．1 藻种、菌种与质粒

2．2 实验仪器

2．3 实验试剂

2．4 常用培养基及试剂配制

3 实验方法

3．1 大肠杆菌感受态的制备

3．2 载体构建步骤

3．3 表达载体转化农杆菌

3．4 农杆菌介导小球藻转化

3．5 小球藻转化子的筛选

3．6 小球藻转化子的阳性鉴定

3．7 转化子小球藻的外观观察

3．8 虾青素提取和测定

4 实验结果与分析

4．1 目的基因的获取

4．2 PDSSP-BKT连接到中间载体

4．3 PDSS-BKT连接到PBI21表达载体

4．4 转化农杆菌

4．5 农杆菌转化小球藻阳性鉴定

4．6 小球藻转化子表型

4．7 虾青素的含量

5 本章小结

第四章 讨论和展望

参考文献

攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况