声明
致谢
摘要
第一章文献综述
1．2(R)-CHBE的制备方法
1．2．1化学法
1．2．2生物法
1．3不对称还原制备(R)-CHBE研究现状
1．3．1不对称还原制备(R)-CHBE的氧化还原酶
1．3．2酶的表达优化和改造
1．3．3固定化
1．3．4反应过程优化
1．4本课题的研究思路及研究内容
2．1引言
2．2实验材料与设备
2．2．1菌种与质粒
2．2．2实验试剂与药品
2．2．3培养基与试剂配制
2．2．4实验仪器与设备
2．3实验方法
2．3．1首种的保藏和活化
2．3．2大肠杆菌感受态细胞制备
2．3．3转化与验证
2．3．4重组菌株的诱导表达
2．3．5首体收集和细胞破碎
2．3．7蛋白质纯化
2．3．8蛋白浓度测定方法
2．3．9羰基还原酶的酶活测定
2．3．10重组氧化还原酶的立体选择性测定
2．4结果与讨论
2．4．1羰基还原酶酶库的构建
2．4．2羰基还原酶出发酶的选择
2．4．3羰基还原酶新酶的挖掘
2．4．4高活力新酶的复筛
2．5本章小结
3．1引言
3．2实验材料与设备
3．3实验方法
3．3．1质粒提取
3．3．2易错PCR突变文库的构建
3．3．3定点饱和突变文库的构建
3．3．4高通量筛选方法的建立
3．3．5突变子的复筛
3．3．6重组羰基还原酶的诱导表达及酶活测定
3．3．7重组氧化还原酶的立体选择性研究
3．4结果与讨论
3．4．1高通量筛选方法的建立
3．4．2建立突变率稳定的易错PCR突变文库
3．4．3易错PCR
3．4．4定点饱和突变
3．4．5组合突变
3．4．6动力学参数的测定
3．4．7同源建模分析
3．5本章小结
4．1引言
4．2实验材料与设备
4．3实验方法
4．3．1普通PCR
4．3．2 DNA凝胶回收
4．3．3快速克隆
4．3．4表达载体构楚
4．3．5重组羰基还原酶菌体收集破碎和诱导表达
4．4．1表达元件对蛋白表达的影响
4．4．2培养条件对蛋白表达的影响
4．4．3诱导条件对蛋白表达的影响
4．5本章小结
第五章双菌双酶反应制备(R)-CHBE
5．1引言
5．2实验材料与设备
5．3实验方法
5．3．1 pH对酶活的影响及pH稳定性
5．3．2温度对酶活的影响及温度稳定性
5．3．3金属离子、EDTA及有机溶剂对酶活的影响
5．3．4双菌双酶催化反应体系的研究
5．3．5底物浓度对催化效率的影响
5．3．6酶量对催化效率的影响
5．3．7双酶的酶活比例对催化效率的影响
5．3．8 NADP+浓度对催化效率的影响
5．4结果与讨论
5．4．1 pH对酶活力的影响及pH稳定性
5．4．2温度对酶活力的影响及温度稳定性
5．4．3金属离子及EDTA对酶活的影响
5．4．4有机溶剂对酶活的影响
5．4．5底物浓度对催化效率的影响
5．4．6酶量对催化效率的影响
5．4．7双酶比例对催化效率的影响
5．4．8 NADP+浓度对催化效率的影响
5．5本章小结
6．1结论
6．2展望
参考文献
附录
作者简介
浙江大学;
