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摘要
第一章 文献综述
1.1 手性化合物概述
1.2 手性化合物制备的主要方法
1.2.1 对映体拆分
1.2.2 化学法合成
1.2.3 生物法合成
1.3 光学活性的β-羟基酯的应用
1.4 COBE和CHBE
1.4.1 4-氯乙酰乙酸乙酯(Ethyl 4-Chloroacetoacetate,COBE)
1.4.2 4-氯-3羟基丁酸乙酯(Ethyl 4-Chloro-3-hydrozybutanoate,CHBE)
1.5 生物法制备S-CHBE
1.5.1 生物法还原COBE生产S-CHBE的机理
1.5.2 辅酶再生
1.5.3 生物制备S-CHBE的研究现状
1.6 本论文的研究目的及意义
1.7 本论文研究的主要内容
第二章 酮还原酶表达载体的构建及高效表达
2.1 引言
2.2 材料和方法
2.2.1 菌株及质粒
2.2.2 培养基
2.2.3 主要实验试剂
2.2.4 主要仪器设备
2.2.5 酮还原酶基因的人工合成
2.2.6 感受态细胞的制备及转化
2.2.7 表达载体pET28a-kred的构建
2.2.8 表达载体pTrc-kred的构建
2.2.9 重组菌培养条件
2.2.10 细胞生长测定
2.2.11 酶活的测定
2.2.12 SDS-PAGE检测目的蛋白
2.2.13 重组菌细胞催化COBE不对称还原反应
2.2.14 底物和产物分析
2.3 重组表达酮还原酶
2.3.1 重组质粒的酶切验证
2.3.2 构建的重组表达菌株
2.3.3 酮还原酶表达体系的筛选
2.3.4 重组菌BL21(DE3)/pET28a-kred的SDS-PAGE分析
2.4 重组菌BL21(DE3)/pET28a-kred培养条件的优化
2.4.1 培养基的选择
2.4.2 诱导时期的优化
2.4.3 IPTG浓度的优化
2.4.4 诱导温度的优化
2.4.5 诱导时间的优化
2.5 重组菌BL21(DE3)/pET28a-kred转化COBE的研究
2.6 小结
第三章 葡萄糖脱氢酶(GDH)基因的表达
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 质粒与菌株
3.2.2 培养基与培养条件
3.2.3 质粒抽提
3.2.4 葡萄糖脱氢酶NDA获得
3.2.5 葡萄糖脱氢酶表达载体的构建
3.2.6 葡萄糖脱氢酶酶活力的测定
3.3 葡萄糖脱氢酶基因的表达
3.4 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-gdh再生辅酶
3.5 小结
第四章 双重组菌偶联不对称还原COBE生产S-CHBE
4.1 引言
4.2 材料和方法
4.2.1 菌种
4.2.2 培养基和培养方法
4.2.3 分析方法
4.3 双重组菌不对称催化还原COBE
4.3.1 催化形式对不对称还原COBE的影响
4.3.2 双菌细胞量比例对不对称还原COBE的影响
4.3.3 细胞量对不对称还原COBE的影响
4.3.4 辅因子及辅酶再生对不对称还原COBE的影响
4.3.5 辅助底物对不对称还原COBE的影响
4.3.6 底物浓度不对称还原COBE的影响
4.3.7 转化温度对不对称还原COBE的影响
4.3.8 pH对不对称还原COBE的影响
4.3.9 转速对不对称还原COBE的影响
4.4 小结
结论
参考文献
致谢
在读期间公开发表论文(著)及科研情况