双重组菌耦合不对称还原生产（R）-或（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的研究

摘要

手性化合物由于其特殊的生物活性，已经在医药、农药、材料、香精香料及昆虫信息素和激素等方面得到广泛的应用。近年来，用手性技术不对称催化合成手性化合物及其手性中间体已经引起了学术界和企业界的重视，成为研究开发的热点。利用微生物酶不对称催化具有反应条件温和、转化率高及立体选择性好等优点，已经成了诸多手性合成方法的首选。本文将以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)作为β-羰基酯还原的模型底物，利用基因工程技术构建的重组大肠杆菌分别表达单一醛基还原酶和羰基还原酶，研究用这两个重组菌分别催化COBE不对称还原为相应R-或S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE)的反应规律。为了解决辅酶再生的问题，构建了表达葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌作为还原型辅酶NADPH的再生系统，研究了分别与上述两个重组菌耦合催化4-氯乙酰乙酸乙酯还原反应的特性。 研究工作的主要进展包括：一、从赭色掷孢酵母(SporobolomycessalmonicolorZJU010)细胞中克隆得到了醛基还原酶(NADPH-dependentaldehydereductase，ALR)基因，构建了含ALR基因的表达质粒并转化到大肠杆菌中。通过筛选，获得高效表达醛基还原酶的重组菌EcoliM15(pQE30-ALR)，经培养和诱导条件优化，该重组菌的比酶活提高到7.28U/mg，比酶活比原始菌株高14倍。在水相反应体系中，选用COBE作为模型底物，重组菌EcoliM15(pQE30-ALR)能够催化COBE不对称还原为纯手性的R-CHBE，e.e.值高达100％，产率为98.5％；而利用赭色掷孢酵母催化的产物产率和e.e.值分别只有64.5％和63.5％。成功地解决了用酵母细胞催化COBE还原时产物e.e.较低的问题。考察了辅酶及共底物、底物和产物浓度、pH值、温度以及菌体密度等因素对反应的影响。结果表明，由重组菌催化的不对称还原必须在辅酶NADPH和辅酶再生酶系及辅底物葡萄糖的参与下才能进行；底物和高浓度的产物对还原反应有抑制作用；当pH＞6.0时，反应的转化率及产率都会显著降低；高密度重组细胞可以减少底物的抑制作用；通过分批加入底物的方式可以有效缓解水相体系底物的抑制，产物浓度可达90mmol/L。 二、为了解决重组菌M15(pQE30-ALR)催化还原反应中还原型辅酶NADPH不足的问题，分别从巨大芽孢杆菌B.megateriumAS1.223和B.megateriumAS1.151中克隆到了两个葡萄糖脱氢酶(glucosedehydrogenase，GDH)基因gdh151和gdh223，并构建了重组菌EcoliM15(pQE30-gdh223)和M15(pQE30-gdh151)。对这两个重组菌进行诱导表达，结果发现前者的GDH比酶活是后者的11倍。对两个葡萄糖脱氢酶氨基酸序列分析结果发现，GDH223与GDH151仅有一个氨基酸差异，即GDH223的Arg39和GDH151的Ser39的差异。由于Arg39是葡萄糖脱氢酶催化NADP+还原活性中心必不可少的部分，正是因为这个差异造成重组菌M15(pQE30-gdh151)表达的GDH151酶蛋白失活。对重组菌M15(pQE30-gdh223)培养和诱导条件进行了优化，比酶活可达4.45U/mg，单位体积发酵液酶活可达31U/mL。在此基础上对重组菌M15(pQE30-gdh223)产生辅酶和催化辅酶再生的能力进行了考察，证实重组菌表达的酶蛋白具有与商品酶同样的辅酶再生能力。初步验证了重组菌M15(pQE30-gdh223)作为辅酶NADPH的再生系统，分别在与重组菌M15(pQE30-ALR)耦合催化COBE不对称还原反应及与丙酮干细胞协同催化COBE还原反应中起到提供辅酶和辅酶再生的作用。所构建的辅酶NADPH再生系统简单而且有效，可以应用于其它生物不对称催化还原体系。 三、研究了由重组菌M15(pQE30-gdh223)与重组菌M15(pQE30-ALR)耦合系统催化COBE不对称还原反应的特点，考察了水相反应体系中，底物浓度、双菌的质量比、葡萄糖浓度、温度和转速对双菌反应体系的影响。结果表明，底物浓度对双菌转化反应有一定的抑制，[COBE]＞60mmol/L，产物产率明显降低；当葡萄糖浓度为200mmol/L、温度为34℃、摇床转速100r/min，M15(pQE30-ALR)与M15(pQE30-gdh223)湿细胞质量比为4：1的情况下，有最高的转化效率。采用分批流加底物的操作方法，产物终浓度达到124mmol/L。初步研究了在邻苯二甲酸二丁酯/磷酸钾缓冲液两相体系中，双菌体系在当初始底物浓度为360mmol/L时，产物总浓度为283mmol/L，产率达到了78.6％。两相体系可以有效地缓解底物和产物的抑制，但是对产物的e.e.值降低到了87％。 四、分别研究了有辅酶参与的重组菌表达醛基还原酶和葡萄糖脱氢酶催化双底物反应的动力学，结果表明，两个反应都可以用OrderedBiBi反应机理描述，并从实验数据回归得到了动力学公式的常数，所得到的醛基还原酶(ALR)和葡萄糖脱氢酶(GDH)酶催化反应动力学方程可分别表示为： vALR=1.85[NADPH][COBE]/[NADPH][COBE]+0.273[COBE]+0.21[NADPH]+0.218vGDH=22.327[NADP+][glu]/[NADP+][glu]+0.145[glu]+0.182[NADP+]+0.0473上述数学模型可以用于描述双菌耦合体系催化COBE还原为(R)-CHBE的间歇过程。五、从木兰假丝酵母(CandidamagnoliaZJU106)克隆得到了羰基还原酶(NADPH-dependentcarbonlyreducase，CAR)的基因，并成功地在大肠杆菌中表达。在水相体系中，重组菌M15(pQE30-CAR)能催化COBE不对称还原为单一手性纯的(S)-CHBE，e.e.值约为100％。而用木兰假丝酵母催化得到的产物e.e.值仅为57.5％。进一步考察了重组菌M15(pQE30-CAR)和重组菌M15(pQE30-gdh223)耦合体系催化COBE不对称还原反应中的规律，结果表明，高浓度底物对反应有抑制作用，但不如重组菌M15(pQE30-ALR)那么明显；双菌体系对温度比较敏感，在32-34℃之间有较高的产率；当重组菌M15(pQE30-CAR)与M15(pQE30-gdh223)湿细胞质量比为2：1时，产率最高。在邻苯二甲酸二丁酯/磷酸钾缓冲液两相体系中，双菌体系在300mmol/L底物浓度情况下，产物总浓度为208.9mmol/L，产率为69.7％，两相体系可以较好的解决底物和产物的抑制。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章绪论

1.1手性化合物的重要性和研究现状

1.1.1手性化合物的重要性

1.1.2手性技术的研究现状

1.2制备手性化合物的主要方法

1.2.1手性拆分

1.2.2化学合成

1.2.3生物催化

1.3微生物催化手性合成的特点和优势

1.4生物催化β-羰基酯不对称还原反应研究进展

1.4.1微生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称合成的原理

1.4.2催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原的微生物

1.4.3酵母细胞中催化β-羰基酯不对称还原的酶

1.4.4生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原的方法

1.4.5影响微生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯的因素

1.5不对称还原反应过程中的辅酶再生问题

1.5.1酶偶联法再生

1.5.2电化学法

1.5.3光化学法

1.5.4利用微生物细胞辅酶再生

1.6微生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯还原反应的酶动力学

1.7本课题拟研究的内容

参考文献

第二章材料与方法

2.1试验材料

2.1.1质粒

2.1.2菌株

2.1.3工具酶与试剂

2.1.4培养基

2.1.5主要仪器

2.2试验与分析方法

2.2.1分子克隆试验

2.2.2菌体浓度测定

2.2.3重组菌细胞超声破碎及胞内酶蛋白提取

2.2.4蛋白浓度测定

2.2.5 SDS-PAGE电泳

2.2.6重组菌表达酶的比活性(specific activity)测定

2.2.7气/液相色谱测定底物和产物及e.e.值计算

2.2.8数据处理方法

参考文献

第三章醛基还原酶基因克隆、表达载体的构建及表达条件优化

3.1引言

3.2材料和方法

3.2.1质粒

3.2.2菌株和培养基

3.2.3酶和试剂盒

3.2.4质粒提取和转化

3.2.6不同表达菌株的构建

3.2.7菌体培养及酶蛋白表达

3.2.8重组表达菌醛基还原酶活的测定

3.2.9重组菌株不对称还原反应体系

3.2.10细胞活性的检测

3.2.11产物气/液相检测及e.e.值

3.3结果与讨论

3.3.1不同转化子表达醛基还原酶活性测定

3.3.2重组菌株M15(pQE30-ALR)与原始酵母菌株酶活性比较及酶蛋白表达

3.3.3重组菌株M15 (pQE30-ALR)培养条件和诱导条件的优化

3.4小结

参考文献

第四章重组大肠杆菌表达醛基还原酶不对称还原生产R-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的研究

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1试验材料

4.2.2试验方法

4.3结果与讨论

4.3.1重组菌表达醛基还原酶不对称还原COBE的反应特性

4.3.2辅酶再生对重组细胞催化COBE不对称还原反应的影响

4.3.3底物浓度对重组细胞不对称还原反应的影响

4.3.4产物浓度对重组细胞催化COBE不对称还原反应的影响

4.3.5 pH值对重组细胞催化COBE不对称还原反应的影响

4.3.6反应温度对重组细胞催化COBE不对称还原反应的影响

4.3.7细胞密度对重组细胞催化COBE不对称还原反应的影响

4.3.8分批加入底物提高重组菌不对称还原反应的产率

4.4小结

参考文献

第五章重组菌高效表达葡萄糖脱氢酶及在还原型辅酶NADPH再生中的应用

5.1引言

5.2材料与方法

5.2.1试验试剂

5.2.2质粒与菌株

5.2.3培养基与培养条件

5.2.4葡萄糖脱氢酶基因的克隆

5.2.5葡萄糖脱氢酶表达载体的构建

5.2.6葡萄糖脱氢酶酶活力的测定

5.2.7还原型辅酶NADPH浓度的测定

5.2.8产物气相和液相色谱测定

5.3结果与讨论

5.3.1重组菌表达葡萄糖脱氢酶的性质

5.3.2克隆和重组表达的葡萄糖脱氢酶基因的测序及同源性分析

5.3.3重组菌表达葡萄糖脱氢酶酶比活性的测定

5.3.4重组菌M15(pQE30-gdh223)表达葡萄糖脱氢酶条件优化

5.3.5重组菌M15 (pQE30-gdh223)实现辅酶的产生与再生

5.3.6重组菌M15 (pQE30-gdh223)在生物催化不对称反应中的应用

5.4小结

参考文献

第六章重组菌E. coli M15 (pQE30-gdh223)与E. coli M15 (pQE30-ALR)耦合催化COBE不对称还原的研究

6.1引言

6.2材料和方法

6.2.1菌种

6.2.2培养基及培养方法

6.2.3酶活测定和细胞活性的研究

6.2.4不对称还原反应体系

6.2.5气相和液相色谱检测

6.3结果和讨论

6.3.1两重组菌耦合实现还原型辅酶再生的反应机理

6.3.2底物浓度和两种重组菌质量比对双菌耦合转化反应的影响

6.3.3反应温度对双菌耦合转化反应的影响

6.3.4葡萄糖浓度对双菌耦合转化反应的影响

6.3.5转速对双菌耦合转化反应的影响

6.3.6底物分批加入对提高双菌耦合转化率的影响

6.3.7两相体系双菌耦合转化COBE的研究

6.4小结

参考文献

第七章葡萄糖脱氢酶和醛基还原酶协同催化COBE不对称还原反应的酶动力学研究

7.1引言

7.2材料与方法

7.2.1试验试剂

7.2.2初酶提取与纯化

7.2.3酶蛋白浓度测定

7.2.4反应初速度测定

7.2.5产物气相和液相色谱检测

7.2.6数学模型的建立

7.3结果与讨论

7.3.1传质对酶的影响

7.3.2醛基还原酶催化COBE还原反应的动力学常数的确定

7.3.3葡萄糖脱氢酶催化COBE还原反应的动力学常数的确定

7.4双酶耦合辅酶循环再生催化COBE还原反应动力学

7.4.1双酶体系反应初速度的求解

7.4.2双酶的酶活性比对双酶体系转化效率的影响

7.4.3总辅酶浓度对双酶体系转化效率的影响

7.4.4对双酶体系辅酶随时间变化曲线的模拟

7.5小结

参考文献

第八章双菌耦合体系催化COBE不对称还原生产S-CHBE的研究

8.1引言

8.2材料和方法

8.2.1质粒、菌种和菌体培养

8.2.2工具酶和试剂盒

8.2.3羰基还原酶基因的克隆

8.2.4羰基还原酶表达载体的构建

8.2.5羰基还原酶酶活测定

8.2.6转化反应体系

8.2.7产物气相和液相检测

8.3结果与讨论

8.3.1培养基的优化

8.3.2诱导时间和诱导剂量的优化

8.3.3表达时间的确定

8.3.4重组菌与原始菌株比酶活的比较

8.3.5重组菌表达羰基还原酶不对称还原COBE的反应产物检测

8.3.6辅酶再生对重组菌E.coliM15(pQE30-CAR)不对称还原COBE的影响

8.3.7底物浓度对单菌转化及双菌耦合转化体系产率的影响

8.3.8 E. coli M15(pQE30-CAR)及E. coli M15(pQE30-gdh223)质量比对产物得率的影响

8.3.9温度对双菌耦合转化反应的产率的影响

8.3.10两相体系分批补加菌体对双菌耦合转化反应产率的影响

8.4小结

参考文献

结论

本论文符号表

攻读博士学位期间发表的论文

致谢