生防细菌ML12反应调控因子Gac4及小RNA CsrB的生理功能及生防调控解析

摘要

水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）ML12分离于自然土壤中，对多种病原细菌和真菌有拮抗作用，是一株很有潜力的生防细菌。前期完成了双因子调控系统GacS/GacA中的反应调控因子gacA和非编码小RNA csrB在ML12基因组中的定位，本论文主要研究这两个基因在生防功能上的调节机制。此外，对相关的细菌生长、生物膜形成、泳动和群集、溶磷作用、植物促生、生防等生理性状进行了分析。　　 第一步，通过无标记交换突变敲除gacA以及csrB非编码小RNA，得到ML12△gacA和ML12△csrB突变体。首先，确定gacA和csrB在细菌染色体上的定位及编码特征。将目的基因两端侧翼片段插入自杀载体pSR47s中得到pSR47s-gacA和pSR47s-csrB，经两次同源重组和DNA测序鉴定，得到gacA和csrB缺失突变体。其次，以野生菌ML12为对照，比较突变体与野生菌表型和生防效果差异（菌落形态、泳动和群集、生物膜形成、抗菌物质和生防效果等），分析gacA和小RNA csrB在细菌ML12中的作用。　　 结果显示:ML12△gacA、ML12△csrB泳动速度慢于野生菌ML12，32h后泳动圈直径减小25％。ML12△gacA突变体丧失了群集能力。ML12△csrB生物膜形成量约是野生菌两倍，ML12△gacA生物膜形成量下降13.2％。ML12△gacA、ML12△csrB突变体溶磷圈直径减小20％。用ML12△gacA、ML12△csrB菌液处理的向日葵与野生菌处理的相比鲜重分别下降30％和18％。双层平板抑菌结果显示ML12△gacA突变体对根癌菌C58抑菌圈直径减小81.8％。ML12△gacA、ML12△csrB对番茄灰霉的抑菌圈直径分别减小37％和16％。　　 生防细菌发挥生防功效受多种因素影响，功效表现不稳定性制约了生防细菌的应用。本论文结果探明了gacA双因子调控系统和小RNA csrB分子在生防细菌水生拉恩氏菌中的调控特征，明确了其在细菌发生生防功能的正向调控，为生防菌的研究和应用提供了理论基础。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 文献综述

1．1 双因子调控系统概述

1．1．1 双因子调控系统的发现

1．1．2 双因子调控系统的种类

1．2 GacS／GacA双因子调控系统分子调控机制

1．2．1 GacS／GacA双因子调控基本特征

1．2．2 GacS／GacA双因子分子调控机制

1．3 双因子调控系统研究概况

1．3．1 双因子调控系统与细菌表型的关系

1．3．2 双因子调控系统调控细菌游动行为

1．4 双因子调控系统与细菌生防关系

1．4．1 双因子调控系统调控细菌生物防治

1．5 小RNA研究进展

1．5．1 小RNA的发现

1．5．2 小RNA的特征

1．5．3 小RNA的功能

1．5．4 小RNA的作用机制

1．6 基因敲除技术研究进展

1．6．1 基因敲除技术概述

1．6．2 基因敲除主要方法

1．7 水生拉恩氏菌ML12概况

1．7．1 ML12生防细菌概况

1．7．2 ML12细菌基因组基因研究概况

1．8 本课题选题依据，研究目的及意义

1．8．1 本研究选题依据

1．8．2 本研究研究目的

1．8．3 本研究研究内容

1．8．4 本研究技术路线

1．8．5 本研究拟解决的关键问题及创新点

第二章 ML12菌株gacA、csrB自杀载体构建及突变体获得

1 材料与方法

1．1 供试菌株、质粒及引物

1．2 实验仪器设备

1．3 实验所用培养基

1．4 实验所用抗生素及其浓度

1．5 实验所需化学试剂

1．6 实验所用引物合成及序列分析软件

1．7 实验所用各种缓冲液及相关药品配制方法

1．8 CTAB法小量提取细菌基因组DNA

1．9 质粒DNA提取及纯化

1．10 酶切反应体系及连接反应体系

1．11 大肠杆菌DH5α、DH5αλ-pir感受态细胞的小量制备

1．12 质粒热击转化

1．13 克隆产物菌落PCR鉴定

1．14 重组质粒酶切验证

1．15 三亲杂交(获得第一次重组子)

1．16 突变体筛选(获得第二次重组子)

1．17 反应调控因子gacA和小RNA csrB在细菌ML12染色体上的定位

2 结果与分析

2．1 gacA缺失突变体构建

2．2 小RNA csrB缺失突变体构建

2．3 结论与讨论

第三章 ML12菌株gacA、csrB缺失突变体生物学性状检测

1 材料与方法

1．1 实验供试菌株

1．2 接种病原菌的植物材料

1．3 细菌菌落形态变化

1．4 细菌培养液pH检测

1．5 生物膜(biofilm)定性和定量检测

1．6 细菌泳动(swimming)和群集(swarming)

1．7 室内平板拮抗效果检测

1．8 温室防治向日葵根癌病效果检测

1．9 植物促生作用检测

1．10 细菌对病原真菌番茄灰霉的拮抗效果检测

1．11 细菌溶磷能力的定性检测

1．12 数据统计分析

2 结果与分析

2．1 ML12菌株gacA、csrB缺失突变体菌落形态差异

2．2 ML12菌株gacA、csrB缺失突变体培养液pH值变化

2．3 ML12菌株gacA、csrB缺失突变体形成生物膜能力比较

2．4 ML12菌株gacA、csrB缺失突变体泳动和群集能力比较

2．5 ML12菌株gacA、csrB缺失突变体对根癌菌C58拮抗作用

2．6 ML12菌株gacA、csrB缺失突变体防治向日葵根癌病效果检测

2．7 ML12菌株gacA、csrB缺失突变体对番茄灰霉拮抗作用检测

2．8 ML12菌株gacA、csrB缺失突变体对向日葵促生作用

2．9 ML12菌株gacA、csrB缺失突变体溶磷能力定性检测

3 结论与讨论

第四章 总结

1 研究小结

2 后期研究展望

参考文献

致谢

作者简介

附录