神经毒素纳米粒在体外血脑屏障上转运特性研究

摘要

目的：本实验建立原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞（Rat brain microvascular endothelial cells，rBMECs）模型为体外BBB模型，考察离体情况下T-80-NT-NP在血脑屏障上的转运特性极其转运机制。　　方法：以PBCA为载体材料，采用乳化聚合法制备NT-NP，经T-80修饰，制得T-80-NT-NP。原代培养大鼠脑微血管内皮细胞（rBMECs），大脑组织碎片经150μm，75μm滤网过滤后，Ⅱ胶酶消化分离得到rBMECs，建立体外BBB细胞模型。MTT法考察T-80和T-80-NT-NP对rBMECs的细胞毒性作用。以体外BBB的rBMECs为细胞模型，考察时间、温度、浓度对T-80-NT-NP摄取、外排的影响。采用Millicell insert结合培养rBMECs，建立跨 BBB转运的体外细胞转运模型，考察T-80-NT-NP在 BBB上的转运特性。　　结果：NT-NP外观呈圆形或类圆形，平均粒径78.3 nm，分散均匀，包封率和载药量分别为80.25％和0.124%，Zeta电位为-15.37 mV；rBMECs培养约5-6天后，生长成致密单层细胞，具有生长接触抑制现象，但未见重叠生长。MTT法，T-80溶液浓度在﹥400 ng·mL-1时，对rBMECs无显著毒性；含原药NT浓度100~400 ng·mL-1范围之间，原药NT和NP毒性都有浓度依赖性；浓度≥200 ng·mL-1的NP对rBMECs毒性显著增加；NP毒性比原药NT有显著增大，有显著性差异（p<0.01）；T-80包裹NP比未包裹毒性大，但未见显著差异（p>0.05）。NT-NP和T-80-NT-NP在rBMECs上摄取、外排都具有时间、温度、浓度依赖性：无论在37℃和4℃、不同浓度和不同孵育时间条件下，rBMECs对T-80-NT-NP的摄取量和外排时细胞内滞留药物量均显著高于未T-80修饰NT-NP。Millicell insert结合培养rBMECs的跨BBB细胞模型的TEER值为（146.5±1.43Ω·cm2）；NP比原药NT，转运量有极其显著增加（p<0.01）；且T-80-NT-NP比NT-NP，转运量有显著增加（p<0.05）。　　结论：揭示rBMECs对T-80-NT-NP摄取可能是主动内吞过程；P-gp外排系统亦参与了此转运；T-80-NT-NP对rBMECs的细胞毒性可能是透BBB机制之一。本实验方法的建立亦为T-80-NT-NP在rBMECs其他转运机制研究奠定基础。

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主要缩略词

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前言

第一部分 神经毒素纳米粒的制备及表征

一、实验材料

二、方法与结果

三、 分析与讨论

四、小结

第二部分 原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞模型的建立

一、实验材料

二、 方法与结果

三、分析与讨论

四、小结

第三部分 神经毒素纳米粒对原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞毒性的研究

一、实验材料

二、方法与结果

三、分析与讨论

四、小结

第四部分 神经毒素纳米粒在原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞上摄取和外排研究

一、 实验材料

二、 方法与结果

三、分析与讨论

四、小结

第五部分 神经毒素纳米粒在原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞上的转运研究

一、实验材料

二、实验方法

三、分析与讨论

四、小结

全文结论

参考文献

致谢

文献综述:载药纳米粒脑靶向的研究进展