治疗超声联合耦连载MTX纳米粒微泡促药物跨血脑屏障转运的实验研究

摘要

背景和目的：
　　血脑屏障(Blood brain barrier，BBB)是维持中枢神经系统内环境稳定的重要结构，也正是由于其本身结构功能的特点，BBB将许多治疗中枢神经系统疾病的药物拒之门外，导致药物无论是静脉注射还是动脉灌注，都难以在脑组织达到有效浓度，不能充分发挥疗效使其无法在脑内达到有效浓度，影响治疗效果。因此药物在脑组织的疗效不仅取决于病灶对药物的敏感性，更主要的是取决于血脑屏障对药物的通透性。有创性鞘内或脑室穿刺直接给药所需的技术操作要求较高且具有感染风险，限制其应用;对药物进行脂溶性化学修饰、改变分子量大小和电荷，设计针对葡萄糖、氨基酸、肽类等通过BBB的特殊载体，因给药效率低，目前还难以广泛应用于临床。
　　因此，如何无创、可逆、靶向地开放BBB，使治疗药物透过血脑屏障，在脑区达到药物有效治疗浓度是目前国内外学者普遍关注的热点之一。超声联合微泡辐照脑组织，已证实可以达到无创性可逆开放血脑屏障，目前认为，联合应用超声与微泡开放BBB主要是超声波与微泡之间相互作用的结果，其中最主要的生物学效应为空化效应。通过超声波技术构建多功能的跨BBB药物转运系统也逐步走向新的超声治疗研究领域，超声微泡造影剂可用作药物运载体，将药物包载于造影剂微泡中防止药物在体循环中降解失活，结合超声靶向微泡击破(ultra-sound targeted microbubbledestroy，UTMD)技术，可以选择性的将药物在作用部位靶向释放。超声波局部辐照释放被包载药物一方面加大了局部的药物浓度，另一方面也减少了体循环中的药物浓度，从而在增加药物疗效的同时减少了其全身性副作用。
　　“脂氟显”是我科自行研制并具有独立自主知识产权的新型脂膜超声造影剂，经过前期大量动物实验研究证实，无论是在诊断还是在治疗领域，均取得良好的应用研究结果。但载药量较低也成为我们将应用“脂氟显”于治疗领域的一个障碍，同时回顾目前超声造影剂携带药物或基因的相关研究，我们不难发现超声造影剂作为药物或基因载体均有其不可避免的局限性，一方面，造影剂微泡外壳为较薄的脂膜或蛋白膜，在膜上能携带的药物量及基因量均有限，通过透射电镜对“脂氟显”进行检测也证实其外壳由非常薄的膜构成;另一方面，造影剂微泡中心为惰性气体所占据，这就更减少了造影剂微泡携带药物及基因的能力。因此如何提高超声造影剂微泡的载药量成为目前急待解决的问题。
　　纳米微粒是近年来研究较多的新型药物载体，其载药的有效性及其控制释放药物能力在大量研究中得到了证实，尤其是脂质体载药纳米粒，由双层脂膜中心包裹水性核构成，其脂膜上具有携带亲脂性药物及两亲性药物，而中心部的液性部分亦可携带亲水性药物，因此其携载药物的种类较造影剂微泡更广泛。同时，脂质体作为药物载体能降低药物的给药剂量，减轻药物毒性，提高药物的稳定性。研究表明，载药脂质体能使药物在肿瘤部位聚集达到单纯应用药物的50～100倍。但要达到不同部位靶向释放，则需要不同修饰方法进行脂质体的制备。若脂质体能在超声波作用下实现目的治疗区的靶向释放则可减少制备工艺上的烦琐过程，然而，由于脂质体的核心为液态物质，经注射入血液后并不能与超声波产生协同作用的效果，因此超声亦无法对纳米粒实现实时的监测，对于其是否到达目的治疗区亦无从掌握。
　　基于上述“脂氟显”及载药纳米粒的相关特点及其不足，本研究拟在现有制备“脂氟显”的基础上，于其表面耦连上载药脂质体纳米粒，由于脂质体纳米粒粒径较小，造影剂微泡耦连上纳米粒后，其粒径的总体变化不会发生太大的改变，即超声造影剂微泡在超声波声场中的相关物理特性不会发生改变，这样我们就可以解决造影剂微泡载药量低的缺陷，同时利用超声波能有效击破微泡从而在特定部位释放微泡膜上耦连的载药纳米粒，实现脂质体纳米粒在超声辐照场中靶向释放药物的的效果。聚乙二醇(PEG)是脂质体制备中较常用的修饰材料，脂质体中引入PEG后可有效地降低调理素对脂质体纳米粒的亲和性，减少肝脏巨噬细胞对载药脂质体纳米粒的吞噬作用，提高药物的靶向性，并阻碍蛋白质成分与磷脂等的结合，从而延长脂质体在血液中的循环时间，同时，无论是脂质体纳米粒还是造影剂微泡在引入PEG后均能为各自的膜构成上提供有效的空间构架，在此基础上仅对PEG进行一定的修饰即可实现脂质体纳米粒与造影剂微泡的耦连，从而实现本研究中制备新型超声造影剂的设想。
　　由于血脑屏障的作用，化疗药物不易渗入脑膜、眼眶等“盲区”，这些部位的残留白血病细胞是造成中枢神经系统白血病(central nervous system leukemia, CNSL)复发的主要根源。目前，颅脑放疗、鞘内注射化疗药物和大剂量甲氨蝶呤（Methotrexate,MTX）化疗是预防CNSL复发的主要措施，但放疗的后期副作用明显，对内分泌、神经系统均有毒性作用;鞘内注射化疗药物具有创伤性，且易引发感染;大剂量甲氨蝶呤(HDMTX)是目前较为有效的CNSL预防方法之一，但亦存在较大的副作用，同时还可以导致远期的精神毒性。为此，如何使MTX在脑组织病灶内达到有效浓度，并降低其毒副作用，是治疗和预防CNSL的关键所在。
　　本研究目的是在前期制备“脂氟显”造影剂的基础上，制备高效载药的载MTX纳米粒，利用生物素-亲和素桥接法，将载药纳米粒与脂质微泡耦连，制得耦连载MTX纳米粒的新型载药造影剂，并观察其安全性及在超声辐照场中体外释放药物的效果;同时探讨治疗超声联合耦连载MTX纳米粒造影剂促药物跨大鼠血脑屏障转运的能力，并对其机理进行初步探讨，为中枢神经系统疾病治疗探索一种无创、安全的新方法。
　　方法及路线：
　　1.在“脂氟显”制备工艺基础上，制备生物素化“脂氟显”超声造影:
　　将一定比例生物素化磷脂加入原“脂氟显”脂质配方中，适当改变磷脂配比，以库尔特粒度计数仪对制备的造影剂进行粒径分布及浓度进行测定。
　　2.在“脂氟显”制备工艺基础上，制备生物素化载MTX脂质纳米粒:
　　利用二次冷冻干燥法及机械振荡法制备生物素化载MTX的脂质纳米粒，应用柱层析法实现载药纳米粒与游离药物的分离，应用高效液相色谱法对载药纳米粒进行包封率测定，应用Zetasizer3000对纳米粒进行粒径分布测定，透射电镜进行形态学及粒径分布观察与测量。
　　3.生物素化“脂氟显”造影剂与载MTX脂质纳米粒的耦连:
　　制备不同含量生物素化的“脂氟显”造影剂及载MTX脂质纳米粒，利用亲和素—生物素连接体系对两者进行耦连，以漂洗—离心法分离未结合的纳米粒，最终得到耦连载药纳米粒的超声造影剂，应用Coulter Counter对耦连载药纳米粒超声造影剂进行粒径测定;利用制备的造影剂对大鼠肝脏进行造影检查，以了解其增强显像效果;应用高效液相色谱法测定耦连载药纳米粒造影剂MTX携带量。
　　4.耦连载MTX脂质纳米粒微泡体外对肿瘤细胞抑制效果及机制研究:
　　以一定功率治疗超声仪，辐照加入耦连载MTX脂质纳米粒微泡后的肿瘤细胞悬液，应用MTT法及凋亡检测手段测量其对肿瘤细胞的抑制率，并应用扫描电镜观察超声与微泡联合作用后细胞形态变化，以初步了解其作用机制。
　　5.超声联合微泡开放大鼠血脑屏障的实验研究:
　　应用治疗超声仪联合微泡辐照大鼠颅脑，选择不同参数，包括功率、辐照时间、占空比、微泡用量等，以伊文思蓝(Evans-blue，EB)示踪实验评价大鼠BBB开放情况，筛选出最佳辐照参数，并评价其安全性及可逆性。
　　6.超声联合载药微泡促MTX跨大鼠血脑屏障转运的实验研究:
　　分为四组:(1)超声+载药微泡组;(2)超声+微泡+药物组;(3)载药微泡组;(4)药物组。利用高效液相色谱法检测各组脑组织MTX浓度，并通过硝酸镧示踪实验对其机制进行初探。
　　7.体外血脑屏障模型的建立:
　　原代培养BALB/c小鼠脑星形胶质细胞，将小鼠脑微血管内皮细胞(Brainmicrovasular endothelial cell，BMVEC)与星形胶质细胞分别接种于transwell小室多孔滤膜的两面进行共培养，通过跨膜电阻测量，通透性测试，免疫组化ZO-1检测，透射电镜检查评价其形态学及限制通透功能。
　　结果及结论：
　　1.应用冻干技术可以成功制备生物素化超声造影剂，利用二次冻干技术可以实现载甲氨蝶呤脂质纳米粒的制备，该制备方法工艺流程相对简单。
　　2.葡聚糖凝胶柱层析法可以有效实现载药纳米粒与游离药物的分离。
　　3.亲和素—生物素连接体系可以实现脂质微泡与载药纳米粒的耦连，此法值得的载药造影剂粒径符合静脉注射要求，有较高载药量，载药量约(4.91±0.51)mg/ml。
　　4.超声联合耦连载MTX纳米粒微泡能有效抑制肿瘤细胞的增殖，其作用机制与其在细胞表面形成孔洞有关。
　　5.采用MetronAP-170超声波治疗仪，探头频率1MHz，输出功率2.0 W/cm2、占空比20％、辐照时间5min、造影剂剂量0.5ml/kg，可以安全可逆的开放大鼠血脑屏障。
　　6.采用上述参数，超声联合载药微泡可以明显增加MTX跨大鼠血脑屏障转运，与其余三组比较有显著性差异(P＜0.01)，其机制可能与造影剂微泡在超声波的作用下产生的空化作用，引起了血脑屏障紧密连接开放有关。
　　7.脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养模型，在形态学，通透性及屏障性方面具备了BBB的基本特征，可用于药物跨血脑屏障转运的研究。