苯并芘的早期妊娠毒性研究及五味子乙素调控AhR信号通路在预防HTR8/SVneo细胞损伤中的作用

摘要

目的：　　以雌性SD大鼠和滋养层细胞系HTR8/SVneo为研究载体，分别建立苯并芘及其代谢产物的动物和细胞染毒模型及药物干预模型，探讨苯并芘的早期妊娠毒性机制及AhR信号通路在五味子乙素预防苯并芘代谢产物致人早孕胎盘绒毛膜滋养层细胞损伤中的作用，阐明五味子乙素抗多环芳烃类污染物生殖毒性的机制，为临床开发安全、有效的环境污染防护剂奠定科学基础。　　方法：　　动物实验：将75只雌性SD大鼠随机分为5组：空白对照组、Bap模型组、五味子低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组15只。每日晨起灌胃给药，Bap模型组予BaP2 mg·kg-1·d，五味子低、中、高剂量组分别予五味子提取物40、200、1000 mg·kg-1·d+BaP2 mg·kg-1·d，空白对照组予相同体积的生理盐水。给药15天后制备孕鼠模型，于妊娠第9日处死孕鼠，观察胚胎情况，记录孕鼠各期体质量、子宫连胚总质量并计算脏器系数，透射电镜观察胚胎超微结构变化；氧化损伤试剂盒检测大鼠胚胎组织中SOD、GSH-Px活性水平和MDA含量；ELISA试剂盒检测大鼠胚胎组织8-OHdG含量；荧光定量PCR检测大鼠胚胎中Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA表达水平；Western blot检测大鼠胚胎中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达水平。　　细胞实验：以滋养层细胞系HTR8/SVneo为载体，通过MTS检测细胞活力并明确染毒药物BPDE及保护药物五味子乙素的剂量，构建细胞染毒模型及药物干预模型；利用小RNA干扰技术和载体质粒的构建，分别在HTR8/SVneo细胞株上实现目的基因AhR的沉默和过表达，并通过荧光定量PCR和免疫印迹分别从基因和蛋白水平对转染效率进行验证；荧光定量PCR检测AhR目的基因沉默和过表达前后AhR及其下游CYP1A1 mRNA表达水平及凋亡基因Bax、Caspase-3 mRNA表达水平。　　结果：　　1.大鼠一般情况及胚胎形态学比较：　　与空白对照组相比，Bap模型组大鼠体质量、子宫连胚总系数均下降（P＜0.01）；五味子提取物治疗后，五味子干预组各组孕鼠体质量、子宫连胚总系数水平较Bap模型组不同程度上升(P＜0.01或P＜0.05)。空白对照组及五味子干预组大鼠胚胎肉眼观无明显异常，透射电镜示胚胎超微结构未见明显异常；Bap模型组大鼠胚胎大小不一，表面可见异常出血斑块，电镜示超微结构异常，凋亡细胞增加，胚胎内细胞出现异常凋亡结构。　　2.大鼠胚胎氧化损伤指标SOD、GSH-Px活性及MDA含量比较：　　与空白对照组相比，Bap模型组大鼠胚胎中SOD、GSH-Px活性显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，MDA含量显著升高（P＜0.01）；五味子提取物治疗后，五味子高、中、低组大鼠胚胎中SOD活性较模型组不同程度上升(P＜0.01或P＜0.05)，五味子高剂量组GSH-Px活性较模型组上升（P＜0.05），五味子高剂量组MDA含量较模型组下降（P＜0.05）。　　3.大鼠胚胎DNA损伤指标8-OHdG比较：　　与空白对照组相比，Bap模型组大鼠胚胎中8-OHdG水平显著上升(P＜0.01)；五味子提取物治疗后，五味子高、中剂量组大鼠胚胎中8-OHdG水平较模型组不同程度下降(P＜0.01或P＜0.05)。　　4.大鼠胚胎凋亡指标Bax、Bcl-2、Caspase-3比较：　　与空白对照组相比，Bap模型组大鼠胚胎Bax及Caspase-3 mRNA水平及蛋白表达上调（P＜0.01），Bcl-2 mRNA水平及蛋白表达下调（P＜0.01）；五味子提取物治疗后，五味子高、中、低剂量组大鼠胚胎Bax及Caspase-3 mRNA水平及蛋白表达较模型组出现不同程度下调（P＜0.01或P＜0.05），五味子高、中剂量组大鼠胚胎Bcl-2 mRNA水平及蛋白表达较模型组出现不同程度上调（P＜0.01或P＜0.05）。　　5.BPDE及五味子乙素对细胞活力的影响：　　BPDE可剂量依赖性诱导HTR8/SVneo细胞活力下降，其IC50约为3.54μM，选取5μM（约为IC60）为BPDE的终染毒剂量；Sch B(0.625μM～10μM)对BPDE诱导的HTR8/SVneo细胞活力下降有显著的抑制作用，选取10μM为五味子乙素终干预剂量。　　6.AhR目的基因沉默前后AhR、CYP1A1 mRNA表达水平比较：　　①组内比较：与沉默前未处理组相比，BPDE组AhR、CYP1A1 mRNA表达水平上调（P＜0.01或P＜0.05）；与沉默后未处理组相比，BPDE组AhR、CYP1A1 mRNA表达水平上调（P＜0.01）。与沉默前BPDE组相比，Sch B干预组AhR、CYP1A1 mRNA表达水平下调（P＜0.01）；与沉默后未处理组相比，BPDE组AhR、CYP1A1 mRNA表达水平上调（P＜0.01或P＜0.05）。　　②组间比较：沉默后未处理组、BPDE组及Sch B组AhR、CYP1A1 mRNA表达水平均较沉默前明显下调（P＜0.01）。　　7.AhR目的基因过表达前后AhR、CYP1A1 mRNA表达水平比较：　　①组内比较：与过表达前未处理组相比，BPDE组AhR、CYP1A1 mRNA表达水平上调（P＜0.01）；与过表达后未处理组相比，BPDE组AhR、CYP1A1 mRNA表达水平均上调（P＜0.01或P＜0.05）。与过表达前BPDE组相比，Sch B组AhR、CYP1A1 mRNA表达水平下调（P＜0.01或P＜0.05）；与过表达后未处理组相比，BPDE组AhR mRNA表达水平下调（P＜0.01或P＜0.05），但CYP1A1 mRNA表达水平无显著变化（P＞0.05）。　　②组间比较：过表达后未处理组、BPDE组及Sch B组AhR、CYP1A1 mRNA表达水平均较过表达前明显上调（P＜0.01）。　　8.AhR目的基因沉默前后Bax、Caspase-3 mRNA表达水平比较：　　①组内比较：与沉默前未处理组相比，BPDE组Bax、Caspase-3 mRNA表达水平上调（P＜0.01）；Sch B干预后，Bax、Caspase-3 mRNA表达水平下调（P＜0.01）。与沉默后未处理组相比，BPDE组Bax mRNA表达水平无显著变化（P＞0.05），Caspase-3 mRNA表达水平上调（P＜0.05）；Sch B干预后，Bax mRNA表达水平无显著变化（P＞0.05），Caspase-3 mRNA表达水平下调（P＜0.05）。　　②组间比较：沉默前后未处理组Bax、Caspase-3 mRNA表达均无明显变化（P＞0.05）；沉默前后BPDE组及Sch B组Bax、Caspase-3 mRNA表达水平均下调（P＜0.01或P＜0.05）。　　9.AhR目的基因过表达前后Bax、Caspase-3 mRNA表达水平比较：　　①组内比较：与过表达前未处理组相比，BPDE组Bax、Caspase-3 mRNA表达水平上调（P＜0.01），Sch B干预后，Bax、Caspase-3 mRNA表达水平下调（P＜0.01）。与过表达后未处理组相比，BPDE组Bax、Caspase-3 mRNA表达水平均上调（P＜0.01）， Sch B干预后，Bax、Caspase-3 mRNA表达水平下调（P＜0.01或P＜0.05）。　　②组间比较：过表达后未处理组、BPDE组及Sch B组Bax、Caspase-3 mRNA表达水平均无显著变化（P＞0.05）。　　结论：　　经雌性SD大鼠模型和HTR8/SVneo细胞模型的体内外研究证实，环境污染物苯并芘可对人早孕绒毛膜滋养层细胞产生损伤作用，对早期妊娠大鼠产生生殖毒性，诱导早孕期大鼠胚胎的氧化损伤、DNA损伤及凋亡，五味子提取物可通过抗氧化、抗DNA损伤及抑制凋亡来发挥对胚胎的保护作用，这一保护作用机制可能是通过调控AhR信号通路及凋亡因子来实现的。

目录

封面

声明

致谢

目录

中文摘要

英文摘要

英文缩略词表

综述:五味子乙素的药理作用及其分子机制的研究进展

前言

第一章五味子提取物对苯并芘诱导的早孕期大鼠胚胎损伤的保护作用及机制研究

第一节早孕期大鼠胚胎损伤的形态学研究

第二节五味子提取物抗氧化与抗DNA损伤的效应评估

第三节五味子提取物干预Bap诱导的凋亡机制研究

第二章 AhR信号通路对五味子乙素抑制BPDE诱导的人绒毛膜外滋养细胞损伤的保护作用及机制

第一节五味子乙素与BPDE对HTR8/SVneo细胞活力的影响

第二节siRNA干扰AhR基因对下游基因及凋亡基因表达的影响

第三节AhR基因在HTR8/SVneo细胞株中过表达载体的构建

第四节AhR基因过表达对其下游基因及凋亡基因表达的影响

讨论

1 Bap生殖毒性模型的建立

2 Bap对早孕期雌性大鼠及胚胎毒性作用分析

3 Bap诱导胚胎损伤的机制分析

4 五味子保胎作用与中医理论研究

5 五味子提取物对Bap诱导的胚胎损伤保护作用及机制分析

6 HTR8/SVneo细胞株染毒模型的建立

7 AhR信号通路在五味子乙素预防BPDE诱导的HTR8/SVneo损伤中的作用分析

结论

创新点

参考文献

附录一

附录二

附录三

攻读学位期间发表论文情况