AchGLK基因提高番茄果实品质以及青霉菌LysM家族基因的研究

摘要

GLK基因是影响叶绿体发育，细胞分裂，衰老等的一个重要基因。从猕猴桃中克隆了1个与叶绿体发育有关的基因Ach17g471351.2(AchGLK)，该基因存在两个不同的转录本，AchGLKF和AchGLK+48，两者相差48bp。AchGL结构保守，C端有高度保守的GCT-box，DNA结合区域(DBD)有一段AREAEAA保守序列。AchGLKF以及AchGLK+48广泛存在于红阳猕猴桃各组织中以及不同品种的猕猴桃。AchGLK+48过表达转基因番茄与野生型番茄相比则无明显差异。AchGLKF过表达转基因番茄未成熟的果实为深绿色，叶绿素a/b的含量显著增加，质体数量增多，体积变大，叶绿体的数量也显著增加，基质片层数量增加，但腔体大小无明显差异。成熟的AchGLKF转基因番茄的果皮呈深红颜色，带有深色斑点。番茄红素，β-类胡萝卜素以及总类胡萝卜素，葡萄糖、果糖、蔗糖以及可溶性固形物的含量均显著提高。代谢组分析表明，AchGLKF基因可能提高了番茄的胆碱降解，甜菜碱生物合成，藏花酸生物合成，角质生物合成，类胡萝卜素裂解等代谢途径中的部分代谢物含量。AchGLKF基因改良果实品质在实际生产应用中有着重要创新和意义。
　　效应因子在病原微生物和宿主相互作用过程中有着重要的生理功能。首先建立了挖掘P.expansum效应蛋白的方法，共获得了45个可靠的核心效应蛋白基因以及104个重要效应蛋白基因。这些基因在青霉菌侵染水果寄主的过程可能起着重要的作用，主要包括PEX2_004440，PEX2_101850，PEX2_107240，PEX2_094840，PEX2_009280，PEX2_038230,PEX2_017860等。
　　部分LysM家族蛋白是一类重要的效应因子，在病原菌与宿主之间信号传导和相互识别过程中有着重要的生物学功能。P.expansum共有19个LysM家族基因(PeLysM)，本研究敲除了PeLysM4-PeLysM19基因，通过表型分析获得了一些重要的LysM家族基因如PEX2_025087(PeLysM12)以及PEX2_101830(PeLysM15)。深入的研究了PeLysM15基因，该基因编码果胶裂解酶。PeLysM15基因突变体的果胶裂解酶活性明显降低，但果胶酶的活性明显升高。PeLysM15基因的缺失导致P.expansum在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上生长较缓，侵染水果速度加快。PeLysM15基因的突变影响青霉菌孢子管延伸，突变体在液体培养基（离体）和在苹果（活体寄主）上生长时分泌较多的NH4+，NH4+诱导苹果产生较多的自由基，加速宿主细胞的凋亡。代谢组分析表明，该基因的突变会导致P.expansum氨基酸代谢途径或氨基酸代谢有关的辅酶途径异常。获得的P.expansum效应因子，为水果采后病害的防治奠定了基础，具有重要意义。

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摘要

图目录

表目录

第一章 绪论

1．1．2 Golden2 like转录因子的进化与结构

1．1．3 Golden2 like转录因子与环境胁迫

1．1．4 Golden2 like转录因子的其他生物学功能

1．2 基因工程技术提高果实营养品质

1．3 青霉菌与水果采后病害

1．3．1 青霉菌(Penicillium)的鉴定与分类

1．3．2 青霉菌及其代谢物的应用

1．3．3 青霉菌与基因组

1．4 水果病害青霉菌与植物宿主之间的相互作用

1．4．1 植物的免疫系统

1．4．2 LysM家族蛋白与效应因子

1．5 本课题研究的目的与意义

第二章 外源表达猕猴桃GLK基因提高番茄果实品质

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 数据集

2．2．2 生物信息分析平台和方法

2．2．3 猕猴桃GLK基因的克隆与鉴定

2．2．4 实验材料

2．2．5 实验方法

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 红阳猕猴桃中GLK基因

2．3．2 AchGLK基因的克隆

2．3．3 猕猴桃AchGLK基因的2个转录本

2．3．4 AchGLK的两个转录本在红阳猕猴桃中的表达谱

2．3．5 AchGLK在番茄果实中的表达与表型

2．3．6 AchGLKF的过表达提高番茄果实叶绿素的含量

2．3．7 AchGLKF的过表达影响番茄果实叶绿体的发育

2．3．8 AchGLKF的过表达提高番茄果实营养品质

2．3．9 AchGLKF过表达成熟番茄代谢组分析

2．4 本章小结

第三章 p．expansum效应因子与PeLysM家族基因

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 P．expansum效应因子的挖掘

3．2．2 PeLysM家族基因预测

3．2．3 PeLysM家族基因进化分析

3．2．4 PeLysM家族基因的表达水平

3．2．5 PoLysM家族基因的敲除

3．2．6 ΔPeLysM突变体的鉴定

3．2．7 ΔPeLysM突变体的表型分析

3．3 结果与分析

3．3．1 P．expansum分泌蛋白组

3．3．2 P．expansum效应因子

3．3．3 P．expansum核心效应因子和重要效应因子

3．3．4 P．expansum含有19个PeLysM家族基因

3．3．5 PeLysM家族蛋白进化分析与结构域

3．3．6 PeLysM家族基因表达量各不相同

3．3．7 PeLysM家族基因的敲除

3．3．8 ΔPeLysM生长表型检测

3．4 讨论

3．5 本章小结

第四章 PeLysM15基因及其突变体

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．4 ΔPeLysM15在含有水果汁PDA平板上的扩展

4．2．7 野生型霉菌和ΔPeLysM15孢子管的测量

4．2．8 酶的提取及酶活测定

4．2．9 ΔPeLysM15侵染的苹果组织和霉菌中ROS的检测

4．2．10 MDA的测定

4．2．11 NH4+-N浓度的测定

4．2．12 霉菌侵染水果中SA含量的测定

4．2．14 PeLysM15猕猴桃宿主相互作用的蛋白

4．3 结果与分析

4．3．2 果汁对ΔPeLysM15突变体在PDA平板上扩展速度的影响

4．3．4 ΔPoLysM15基因突变影响孢子管发育

4．3．5 PeLysM15基因序列

4．3．6 PeLysM15蛋白含有果胶裂解酶结构区

4．3．7 ΔPoLysM15基因突变引起氨代谢异常

4．3．8 PeLysM15突变体氨基酸代谢途径或辅酶代谢途径发生改变

4．3．9 铵离子诱导苹果产生过量的活性氧

4．3．10 过量的活性氧能够较强的诱导苹果的免疫系统

4．3．11 过量的活性氧能够较强的氧化宿主膜系统

4．3．13 PeLysM15酵母筛库结果

4．4 讨论

4．5 本章小结

第五章 问题与展望

参考文献

附录

作者简介