番茄甘露聚糖酶基因家族进化表达分析及该家族基因沉默植株的构建

摘要

细胞壁是植物非常特殊的一种结构。在植物细胞的生长和分化过程中，逐渐分泌和沉淀形成了初生细胞壁和次生细胞壁。这两种细胞壁主要都由纤维素、半纤维素和果胶这些多糖类物质构成。细胞壁能够维持植株机械支持力、参与物质信号转换以及逆境应激反应等。
　　在构成植物细胞壁半纤维素的多糖中，有一种近些年来逐渐受到重视的多糖，即甘露聚糖。这种多糖成分依据其组成单体种类和含量的不同而被分类为纯甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖等四种形式。在许多植物组织的细胞壁中，甘露聚糖普遍存在且含量丰富。例如，植物种子胚乳、果实和多年生植物的木质部等。
　　甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)又被称为β-1，4-甘露聚糖内切酶，是甘露聚糖水解过程中的关键酶，它能随机裂解甘露聚糖骨架中的β-1，4糖苷键。迄今，此类酶在植物界已经被广泛而深入的研究。虽然这类酶的生化功能相似，但是它们在生物学功能层面却表现出较大差异。
　　本研究利用计算生物学方法在番茄和大豆的基因组数据中对甘露聚糖酶基因进行了搜索和鉴定，再采用比较基因组学的策略将拟南芥、番茄和大豆的甘露聚糖酶基因的结构、进化进行分析，对番茄甘露聚糖酶基因进行了组织特异性表达分析。构建了抑制番茄甘露聚糖酶基因的干扰表达载体，转化番茄品种MicroTom获得表达抑制的植株，为进一步研究番茄甘露聚糖酶各基因在不同组织器官及不同的生长发育阶段中的功能和遗传育种中的基因改造工作提供参考。
　　研究的结果如下:
　　(1)利用计算生物学方法，有11个和20个甘露聚糖酶基因分别从番茄和大豆基因组中被鉴定出来。拟南芥、番茄和大豆三物种的蛋白序列比对后，一些保守基序和氨基酸残基被发现。基因结构和系统发生综合分析表明植物甘露聚糖酶基因内含子的丢失在基因进化方面发挥着重要的作用。多物种的进化分析表明植物甘露聚糖酶的分化可能出现在低等和高等植物分化之后。
　　(2)通过对甘露聚糖酶基因的启动子序列和它们组织特异表达的分析，表明甘露聚糖酶不仅参与到番茄各组织器官的生长发育过程，而且还与植株逆境胁迫下的应答反应相关。
　　(3)通过对已经克隆的4个甘露聚糖酶基因进行序列比对，人工选取了干扰的靶片段，正反两向连入植物RNA干扰表达载体，番茄甘露聚糖酶基因家族RNA干扰的表达载体pTCK303-LeMANs被成功构建。
　　(4)利用番茄品种MicroTom，采用潮霉素作为筛选抗性，通过农杆菌(EHA105)介导法转化。5株再生植株PCR检测结果均呈阳性。5株阳性植株LeMAN2/5基因表达量均下调。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 本研究的目的和意义

1．2 文献综述

1．2．1 植物细胞壁

1．2．2 番茄及其它植物甘露聚糖酶的研究进展

1．2．3 植物RNA干扰的研究

1．2．4 番茄遗传转化体系的研究

1．3 本研究的内容和技术路线

1．3．1 研究的内容

1．3．2 技术路线

2 材料与方法

2．1 番茄甘露聚糖酶基因家族的鉴定及生物信息学分析

2．1．1 数据库

2．1．2 分析软件和方法

2．2 番茄甘露聚糖酶基因家族组织特异性表达分析(半定量PCR)

2．2．1 材料

2．2．2 方法

2．3 番茄甘露聚糖酶基因家族RNA干扰表达载体的构建

2．3．1 材料

2．3．2 方法

2．4 植物RNA干扰表达载体转化农杆菌

2．4．1 农杆菌感受态细胞的制备

2．4．2 表达载体转化农杆菌(冻融法)

2．4．3 Ti质粒的筛选和鉴定

2．5 番茄再生体系的建立和遗传转化

2．5．1 材料

2．5．2 方法

2．6 转基因植株的PCR检测

2．6．1 材料

2．6．2 方法

2．7 转基因植株的RT-PCR检测

2．7．1 转基因番茄RNA提取和RT-PCR

3 结果与分析

3．1 番茄甘露聚糖酶基因家族

3．2 番茄甘露聚糖酶基因家族的生物信息学分析

3．2．1 染色体分布

3．2．2 蛋白序列比对和保守结构分析

3．2．3 基因结构分析

3．2．4 基因的亲缘关系

3．2．5 保守基序分析

3．2．6 植物甘露聚糖酶基因的进化分析

3．2．7 启动子分析

3．3 番茄甘露聚糖酶基因组织特异表达

3．4 番茄RNA干扰表达载体pTCK303-LeMANs的构建

3．4．1 RNA干扰靶片段的克隆

3．4．2 RNA干扰中间载体pTCK303-SC的构建

3．4．3 RNA干扰表达载体pTCK303-LeMANs的构建

3．5 番茄RNA干扰表达载体转化农杆菌

3．6 番茄的遗传转化

3．7 转基因植株的PCR和RT-PCR检测

3．7．1 PCR检测

3．7．2 RT-PCR检测

4 讨论

4．1 番茄甘露聚糖酶基因家族

4．2 番茄甘露聚糖酶基因的进化

4．3 番茄甘露聚糖酶基因的生物学功能

4．4 番茄RNA干扰载体构建和干扰效果

4．5 番茄的遗传转化

4．6 转基因植株的检测以及后期试验规划

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文