番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体及其构建方法和应用，该沉默表达载体含有一个双链RNA表达单元，包括启动子、TomloxACD拼接基因正向片段、TomloxACD拼接基因反向片段和终止子，TomloxACD拼接基因由TomloxA基因片段(SEQIDNo.1)、TomloxC基因片段(SEQIDNo.2)和TomloxD基因片段(SEQIDNo.3)拼接而成；通过农杆菌介导将该沉默表达载体转入野生型番茄中获得的转基因阳性植株所结果实的α-亚麻酸和亚油酸含量均较非转基因植株明显增加，说明该沉默表达载体可用于高不饱和脂肪酸果实番茄植株的育种，在改良番茄果实品质、提高番茄果实营养价值方面具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种基因沉默表达载体，还涉及该基因沉默表达载体的构建方法，以及该基因沉默表达载体在植物育种中的应用。

背景技术

番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)为茄科的一种重要农作物，是全世界栽培最为普遍的果菜之一。必需脂肪酸是机体生命活动必不可少，但机体自身不能合成或合成速度慢无法满足机体需要，必须由食物供给的多不饱和脂肪酸，主要包括α-亚麻酸和亚油酸两种。基因工程育种目前已成为植物育种领域的一个重要分支，在定向改良植物特性方面显示出极大的潜力。近年来，利用转基因技术增加番茄的抗病虫、抗除草剂和抗盐碱性能的报道相对较多，但利用转基因技术提高番茄果实中不饱和脂肪酸含量尚未见报道。

植物脂肪氧化酶(LOX)是一类含非血红素铁的蛋白质，专一催化具有顺,顺-1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸(包括α-亚麻酸、亚油酸、花生四烯酸等)的加氧反应，氧化生成具有共轭双键的过氧化氢物。因此，沉默番茄脂肪氧化酶家族的表达，有望提高番茄中具有顺,顺-1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸特别是必需脂肪酸的含量。番茄中存在五个LOX同工酶基因：TomloxA、TomloxB、TomloxC、TomloxD和TomloxE。其中，TomloxA、TomloxB和TomloxE相互之间的氨基酸序列一致性为72%-77%，TomloxC和TomloxD与TomloxA的氨基酸序列一致性分别为42%和47%，TomloxC与TomloxD的氨基酸序列一致性为46%；TomloxA、TomloxB和TomloxE在果实中表达，TomloxC在成熟果实的转色期和红熟期可以检测到，在叶片和花器中也有表达，而TomloxD主要在番茄叶中表达。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体，目的之二在于提供所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体的构建方法，目的之三在于提供含有所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体的微生物转化体，目的之四在于提供所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体在番茄植株育种中的应用，目的之五在于提供利用所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体进行番茄植株育种的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1．番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体，含有一个双链RNA表达单元，所述双链RNA表达单元包括启动子、TomloxACD拼接基因正向片段、TomloxACD拼接基因反向片段和终止子，所述TomloxACD拼接基因由TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段拼接而成，所述TomloxA基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述TomloxC基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述TomloxD基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

进一步，所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体是以pBIN19载体为骨架，双链RNA表达单元插入pBIN19载体的多克隆位点中，所述双链RNA表达单元包括CaMV 35S启动子、TomloxACD拼接基因正向片段、GFP基因开放读码框、TomloxACD拼接基因反向片段和CaMV 35S终止子。

2．所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体的构建方法，包括以下步骤：

a．TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段的克隆：以野生型番茄幼叶总RNA为模板，反转录得到cDNA第一链，再以所得cDNA第一链为模板，分别以TomA-f和TomA-r、TomC-f和TomC-r、TomD-f和TomD-r为引物，PCR扩增TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段，所述TomA-f和TomA-r的核苷酸序列分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，所述TomC-f和TomC-r的核苷酸序列分别如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示，所述TomD-f和TomD-r的核苷酸序列分别如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示；然后，将所得TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段分别与pMD18-T载体连接，获得重组质粒TomloxA-T、TomloxC-T和TomloxD-T；

b．TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段的拼接：将重组质粒TomloxA-T用BglII和SalI双酶切，回收纯化重组质粒TomloxA-T线性片段，另将重组质粒TomloxC-T用BamHI和SalI双酶切，回收纯化TomloxC基因片段，再将纯化的重组质粒TomloxA-T线性片段与TomloxC基因片段连接，获得重组质粒TomloxAC-T；然后，将重组质粒TomloxAC-T用SalI单酶切，回收纯化重组质粒TomloxAC-T线性片段，另将重组质粒TomloxD-T用XhoI和SalI双酶切，回收纯化TomloxD基因片段，再将纯化的重组质粒TomloxAC-T线性片段与TomloxD基因片段连接，获得重组质粒TomloxACD-T；

c．番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体的构建：将重组质粒TomloxACD-T用XbaI和SphI双酶切，回收纯化TomloxACD拼接基因片段，再与经同样双酶切的pDHG5.2载体连接，获得重组质粒pDHG5.2-GFP-rTomloxACD-T35S；然后，将重组质粒TomloxACD-T用KpnI和BamHI双酶切，回收纯化TomloxACD拼接基因片段，再与经同样双酶切的重组质粒pDHG5.2-GFP-rTomloxACD-T35S连接，获得重组质粒pDHG5.2-P35S-fTomloxACD-GFP- rTomloxACD-T35S；再后，将重组质粒pDHG5.2-P35S- fTomloxACD-GFP-rTomloxACD-T35S用EcoRI单酶切，回收纯化P35S-fTomloxACD-GFP- rTomloxACD-T35S表达单元，再与经同样单酶切的植物表达载体pBIN19连接，即得番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表达载体TomloxACDi-pBIN19。

3．含有所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体的微生物转化体。

进一步，所述微生物为农杆菌，例如根瘤农杆菌LBA4404。

4．所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体在高不饱和脂肪酸果实番茄植株育种中的应用，所述不饱和脂肪酸为具有顺,顺-1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸。

进一步，所述不饱和脂肪酸为α-亚麻酸和亚油酸。

5．利用所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体获得高不饱和脂肪酸果实番茄植株的方法，包括以下步骤：

a．番茄外植体的制备：将番茄种子用体积分数为75%的乙醇溶液消毒，无菌水冲洗，再用饱和磷酸钠溶液浸泡，无菌水冲洗，最后用体积分数为1%的次氯酸钠灭菌，无菌水冲洗，蒸馏水浸泡，播种于含有质量分数为3%的蔗糖和质量分数为0.6%的琼脂、pH为5.8的MS培养基上，在每天25±2℃光照16小时、18±2℃黑暗8小时、光照强度为1000~2000lx的条件下培养；取培养两周的无菌幼苗，剪除子叶的两端部分，并将下胚轴剪成长0.8~1.2cm的小段，再将子叶和下胚轴小段置含有质量分数为3%的蔗糖、0.2mg/L 2,4-D和0.1mg/L激动素、pH为5.8的MS液体培养基中浸泡50~70分钟，再接入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、1.75mg/L玉米素和1mg/L吲哚乙酸、pH为5.8的MS固体培养基中，在每天25±2℃光照16小时、18±2℃黑暗8小时、光照强度为1000~2000lx的条件下预培养1天，制得番茄外植体；

b．农杆菌工程菌液的制备：将含有番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体的农杆菌工程菌株接种于含有质量分数为1.5%的琼脂、50mg/L卡拉霉素、500mg/L链霉素和50mg/L利福平、pH为7.0的YEB固体培养基上，在28±2℃、黑暗条件下培养2天，挑取单菌落，用含有50mg/L 卡拉霉素、500mg/L链霉素和50mg/L利福平、pH为7.0的YEB液体培养基培养2天，再按照体积比为1:100将所得菌液加入上述YEB液体培养基中，过夜扩大培养至OD₆₀₀为1.8-2.0，6000rpm离心，弃上清，菌体用上述YEB液体培养基洗涤后，用等体积、pH为5.8的MS盐溶液重悬，制得农杆菌工程菌液；

c．农杆菌的侵染转化：将步骤a制得的番茄外植体置步骤b制得的农杆菌工程菌液中浸染10~23分钟后，接入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、1.75mg/L玉米素和1mg/L吲哚乙酸、pH为5.8的MS固体培养基中，在每天25±2℃光照16小时、18±2℃黑暗8小时、光照强度为1000~2000lx的条件下共培养2~3天，再转入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、1.75mg/L玉米素、1mg/L吲哚乙酸、500mg/L羧苄青霉素和75mg/L卡拉霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在每天25±2℃光照16小时、18±2℃黑暗8小时、光照强度为1000~2000lx的条件下培养至长出抗性小苗；当抗性小苗长至1~2cm时，将抗性小苗切下，转入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、500mg/L羧苄青霉素和50mg/L卡拉霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在每天25±2℃光照16小时、18±2℃黑暗8小时、光照强度为1000~2000lx的条件下培养至生根，获得转基因番茄植株；

d．转基因阳性植株的获得：从步骤c获得的转基因番茄植株中筛选出转基因阳性植株，即获得高不饱和脂肪酸果实番茄植株。

进一步，所述步骤a中番茄品系为野生型番茄(Lycopersicon esculentum Mill. cv Ailsa Craig)。

进一步，所述番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表达载体中含有NPTII报告基因，所述步骤d通过PCR检测番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表达载体中含有的NPTII报告基因在转基因番茄植株中的表达来筛选转基因阳性植株，所述PCR检测方法是分别取步骤c获得的转基因番茄植株和非转基因番茄植株，提取基因组DNA，再以所得基因组DNA为模板、NPTII-f和NPTII-r为引物进行PCR扩增，所述NPTII-f和NPTII-r的核苷酸序列分别如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示。

本发明中所述MS盐溶液为不含有机物成分的MS液体培养基。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明根据植物脂肪氧化酶催化具有顺,顺-1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸分解代谢的特点以及番茄中五个LOX同工酶基因序列的特点，选取TomloxA基因中与TomloxB和TomloxE基因高度保守的序列以及TomloxC和TomloxD基因的部分序列，构建了番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体，通过农杆菌介导将该沉默表达载体转入野生型番茄(Lycopersicon esculentum Mill. cv Ailsa Craig)中，获得了转基因番茄阳性植株，检测结果显示，转基因番茄阳性植株中脂肪氧化酶家族基因TomloxA、TomloxB、TomloxC、TomloxD和TomloxE的表达以及脂肪氧化酶的活性都较非转基因番茄植株显著降低，转基因番茄阳性植株所结果实中α-亚麻酸和亚油酸的含量都较非转基因番茄植株明显增加，说明该沉默表达载体可用于高不饱和脂肪酸果实番茄植株的育种，在改良番茄果实品质、提高番茄果实营养价值方面具有良好的应用前景。同时，由于TomloxA、TomloxC和TomloxD基因均为番茄自身基因，将其部分序列转入番茄植株中获得的转基因植株也不存在影响环境安全和食用安全的问题。

(2)本发明所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体的构建方法简便易行。

(3)本发明建立的番茄转基因方法转化效率高，具有以下特点：①农杆菌工程菌液的浓度影响菌体在植物细胞上的附着，在一定范围内，菌液浓度越大，附着率越高，转化率越大，但超过该范围，由于菌的毒害作用或生长过快等，会使外植体受到农杆菌过度伤害而导致外植体切口褐化腐烂严重，且不利于共培养后去除农杆菌，而低于该范围，较低的菌液浓度会使T-DNA不能有效地整合进植物细胞基因组中，大大降低转化效果，本发明方法对农杆菌工程菌液的浓度进行了优化，能够有效保证番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体的转化率；②外植体的浸染时间过短，会导致农杆菌不能充分吸附到细胞上而影响转化，而浸染时间过长，外植体的伤口会褐化，且农杆菌污染严重并在后续实验中难以控制，本发明方法对番茄外植体的浸染时间进行了优化，可以充分保障浸染效果；③外植体和农杆菌的共培养是影响转化的重要因素，共培养时间过长会使外植体因农杆菌污染而死亡，时间过短则会使农杆菌感染和DNA转化不充分，从而降低转化率，同时也会增加假转化体的出现，本发明方法对番茄外植体与农杆菌工程菌的共培养时间进行了优化；④本发明方法中番茄外植体在转接入抗性选择培养基前经黑暗处理，可在短时间内诱导出较高频率的转化再生芽；⑤激素是影响再生频率的主要因素之一，不同的激素组合及激素水平对诱导不同外植体愈伤和出芽的影响不同，由于番茄苗对卡那霉素(Kan)很敏感，Kan浓度过低，选择压不足，易产生非转基因植株，而Kan浓度过高不利于芽分化，本发明方法中抗性选择培养基中Kan的浓度优选为75mg/L；⑥本发明方法还对诱导生芽、延长不定芽、选择性生根培养的培养条件进行了优化，25±2℃光照16小时(光照强度为1000~2000lx)、18±2℃黑暗8小时为适宜的培养条件，假阳性植株一般会出现不生长或者生长缓慢现象，仅阳性植株正常生长；⑦采用本发明所述选择生根培养基进行选择性生根培养，生根率能够达到60%以上。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。

图1为TomloxA、TomloxC和TomloxD基因片段的拼接示意图。

图2为番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表达载体TomloxACDi-pBIN19的构建示意图。

图3为PCR检测NPTII报告基因在转基因植株中的表达，其中M为DNA分子量标准，L1、L2和L3分别为转基因阳性植株，NT为非转基因植株。

图4为实时定量PCR检测转基因植株中番茄脂肪氧化酶家族基因的表达，其中NT为非转基因植株，L1、L2和L3分别为转基因阳性植株。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

优选实施例中使用的番茄品系为野生型番茄(Lycopersicon esculentum Mill. cv Ailsa Craig)。质粒pDHG5.2(携带CaMV35S启动子、GFP基因开放读码框和CaMV35S终止子)的构建方法见文献(Kim SH, Grierson D. Subcellular localisation and silencing of ripening-associated membrane protein (TRAMP) in tomato Lycopersicon esculentum Mill. Plant Science, 2005, 169: 1022-1029)，系将GFP基因开放读码框(SEQ ID No.24)插入pDH51载体的多克隆位点中而得到。pMD18-T 载体为Promega公司产品。载体pBIN19和大肠杆菌DH5α由本实验室保存。TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒、限制性内切酶、Taq DNA合成酶等为大连TaKaRa公司产品。超薄/普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)为TIANGEN公司产品。其余试剂均为进口或国产分析纯试剂。

一、番茄TomloxA、TomloxC和TomloxD基因片段的克隆

根据番茄TomloxA mRNA序列(GenBank登录号为U09026，设计如下特异引物，用于PCR扩增TomloxA基因开放读码框中第1350位至第1720位核苷酸(SEQ ID No.1)：

TomA-f：5'-GGTACCGCATGCATATGCCTCGAGAACTTTGC-3'(SEQ ID No.4)，其中下划线部分为KpnI酶切位点，黑体部分为SphI酶切位点，斜体部分为XhoI酶切位点；

TomA-r：5'-CTCGAGGATATCAGATCTCTCCACCAGCATTGATTAGG-3'(SEQ ID No.5)，下划线部分为XhoI酶切位点，黑体部分为EcoRV酶切位点，斜体部分为BglII酶切位点。

根据番茄TomloxC mRNA序列(GenBank登录号为U37839)，设计如下特异引物，用于PCR扩增TomloxC基因开放读码框中第455位至第746位核苷酸(SEQ ID No.2)：

TomC-f：5'-CACCAGATCTGGATCCTAGAAAATGAGCACCACAAG-3'(SEQ ID No.6)，下划线部分为BglII酶切位点，黑体部分为BamHI酶切位点；

TomC-r：5'-GTCGCTCGAGGTCGACCTAACGACTTCTCCGAGATC-3'(SEQ ID No.7)，下划线部分为XhoI酶切位点，黑体部分为SalI酶切位点。

根据番茄TomloxD mRNA序列(GenBank登录号为U37840)，设计如下特异引物，用于PCR扩增TomloxD基因开放读码框中第1250位至第1543位核苷酸(SEQ ID No.3)：

TomD-f：5'-AGATCTGATATCCTCGAGGACAAGCAATAGCAGGAGTG-3'(SEQ ID No.8)，下划线部分为BglII酶切位点，黑体部分为EcoRV酶切位点，斜体部分为XhoI酶切位点；

TomD-r：5'-GATCCTCTAGATAAGTGTGCCAACATCAGAC-3'(SEQ ID No.9)，下划线部分为BamHI酶切位点，黑体部分为XbaI酶切位点。

以野生型番茄(Lycopersicon esculentum Mill. cv Ailsa Craig)幼叶总RNA为模板，根据TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成，再以所得cDNA第一链为模板，分别以TomA-f和TomA-r、TomC-f和TomC-r、TomD-f和TomD-r为引物，PCR扩增番茄TomloxA、TomloxC和TomloxD基因片段。PCR体系为：ddH₂O 16.5μL、10×PCR Buffer 2.5μL、MgCl₂ 2.5μL、dNTP (20μM) 1.0μL、上下游引物各0.5μL、模板1.0μL、Taq DNA合成酶0.5μL，共25μL。PCR循环参数为：94℃预变性2分钟；然后94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共35个循环；最后72℃终延伸10分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，采用超薄/普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收纯化。将纯化的PCR产物即TomloxA、TomloxC和TomloxD基因片段分别与T载体pMD18-T连接，获得重组质粒TomloxA-T、TomloxC-T和TomloxD-T。

二、番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表达载体的构建

按照图1所示将TomloxA、TomloxC和TomloxD基因片段进行拼接：将重组质粒TomloxA-T用BglII和SalI双酶切，回收纯化重组质粒TomloxA-T线性片段，另将重组质粒TomloxC-T用BamHI和SalI双酶切，回收纯化TomloxC基因片段，再将纯化的重组质粒TomloxA-T线性片段与TomloxC基因片段在T4 DNA连接酶作用下连接，获得重组质粒TomloxAC-T；然后，将重组质粒TomloxAC-T用SalI单酶切，回收纯化重组质粒TomloxAC-T线性片段，另将重组质粒TomloxD-T用XhoI和SalI双酶切，回收纯化TomloxD基因片段，再将纯化的重组质粒TomloxAC-T线性片段与TomloxD基因片段在T4 DNA连接酶作用下连接，获得重组质粒TomloxACD-T。

按照图2所示构建番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表达双元载体TomloxACDi-pBIN19：将重组质粒TomloxACD-T用XbaI和SphI双酶切，回收纯化TomloxACD拼接基因片段，再与经同样双酶切的pDHG5.2载体连接，获得重组质粒pDHG5.2-GFP-rTomloxACD-T35S (TomloxACD拼接基因片段反向插入pDHG5.2载体中GFP基因开放读码框与CaMV35S终止子之间)；然后，将重组质粒TomloxACD-T用KpnI和BamHI双酶切，回收纯化TomloxACD拼接基因片段，再与经同样双酶切的重组质粒pDHG5.2-GFP-rTomloxACD-T35S连接，获得重组质粒pDHG5.2-P35S-fTomloxACD-GFP-rTomloxACD-T35S(TomloxACD拼接基因片段正向插入pDHG5.2载体中CaMV35S启动子与GFP基因开放读码框之间)；再后，将重组质粒pDHG5.2-P35S-fTomloxACD-GFP-rTomloxACD-T35S用EcoRI单酶切，回收纯化P35S- fTomloxACD-GFP-rTomloxACD-T35S表达单元，再与经同样单酶切的植物表达载体pBIN19连接，即得番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表达载体TomloxACDi-pBIN19。

三、番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表达载体转化农杆菌

将番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表达载体TomloxACDi-pBIN19采用液氮冷激法转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，再涂布于含有1.5%(w/w)琼脂、50mg/L Kan、500mg/L链霉素(Sm)和50mg/L利福平(Rif)的YEB固体培养基(pH7.0)上，在28±2℃、黑暗条件下培养2天，挑取单菌落，用含有50mg/L Kan、500mg/L Sm和50mg/L Rif的YEB液体培养基(pH7.0)培养2天，取菌液进行PCR鉴定，阳性重组子即为TomloxACDi-pBIN19农杆菌工程菌株，-80℃冻存备用。

四、农杆菌介导的番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表达载体转化番茄

将野生型番茄(Lycopersicon esculentum Mill. cv Ailsa Craig)种子用75%(v/v)乙醇溶液消毒2分钟，无菌水冲洗3次，再用饱和磷酸钠溶液浸泡8-10分钟，无菌水冲洗3次，再用1%(v/v)次氯酸钠溶液灭菌20分钟，无菌水冲洗10次，最后用蒸馏水浸泡5-8小时，播种于含有3%(w/w)蔗糖和0.6%(w/w)琼脂的MS培养基(pH5.8)上，在每天25±2℃光照16小时(光照强度为1000~2000lx)、18±2℃黑暗8小时的条件下培养；取培养两周的无菌幼苗，剪除子叶的两端部分，并将下胚轴剪成长约1cm的小段，再将子叶和下胚轴小段置含有3%(w/w)蔗糖、0.2mg/L 2,4-D和0.1mg/L激动素的MS液体培养基(pH5.8)中浸泡约1小时后，接入含有3%(w/w)蔗糖、0.8%(w/w)琼脂、1.75mg/L玉米素(ZT)和1mg/L吲哚乙酸(IAA)的MS固体培养基(pH5.8)中，在每天25±2℃光照16小时(光照强度为1000~2000lx)、18±2℃黑暗8小时的条件下预培养1天，制得番茄外植体。

将TomloxACDi-pBIN19农杆菌工程菌株接种于含有1.5%(w/w)琼脂、50mg/L Kan、500mg/L Sm和50mg/L Rif 的YEB固体培养基(pH7.0)上，在28±2℃、黑暗条件下培养2天，挑取单菌落，用含有50mg/L Kan、500mg/L Sm和50mg/L Rif的YEB液体培养基(pH7.0)培养2天，再按照体积比为1:100将所得菌液加入上述YEB液体培养基中，过夜扩大培养至OD₆₀₀为1.8~2.0，6000rpm离心，弃上清，菌体用上述YEB液体培养基洗涤后，用等体积MS盐溶液(pH5.8)重悬，制得TomloxACDi-pBIN19农杆菌工程菌液。

将前述番茄外植体置TomloxACDi-pBIN19农杆菌工程菌液中浸染15分钟，用无菌吸水纸吸去多余菌液后，接入共培养培养基(含有3%(w/w)蔗糖、0.8%(w/w)琼脂、1.75mg/L ZT和1mg/L IAA的MS固体培养基，pH5.8)中，在每天25±2℃光照16小时(光照强度为1000~2000 lx)、18±2℃黑暗8小时的条件下共培养2~3天，再转入抗性选择培养基(含有3%(w/w)蔗糖、0.8%(w/w)琼脂、1.75mg/L ZT、1mg/L IAA、500mg/L羧苄青霉素和75mg/L Kan的MS固体培养基，pH5.8)中，在每天25±2℃光照16小时(光照强度为1000~2000lx)、18±2℃黑暗8小时的条件下培养至长出抗性小苗；当抗性小苗长至1~2cm时，将抗性小苗切下，转入选择生根培养基(含有3%(w/w)蔗糖、0.8%(w/w)琼脂、500mg/L羧苄青霉素和50mg/L Kan的MS固体培养基，pH5.8)中，在每天25±2℃光照16小时(光照强度为1000~2000lx)、18±2℃黑暗8小时的条件下培养至生根，获得转基因番茄植株。

五、转基因阳性植株的筛选

根据番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表达载体TomloxACDi-pBIN19中的NPTII报告基因序列，设计如下特异引物：NPTII-f：5'-GTCACTGAAGCGGGAAGGG-3'(SEQ ID No.10)；NPTII-r：5'-CGGCGATACCGTAAAGCAC-3'(SEQ ID No.11)。分别取前述转基因番茄植株和非转基因番茄植株，提取基因组DNA，再以所得基因组DNA为模板、NPTII-f和NPTII-r为引物进行PCR扩增，检测NPTII报告基因在转基因植株中的表达，以筛选转基因阳性植株。PCR体系如前所述；PCR循环参数为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，63℃退火30秒，72℃延伸40秒，共35个循环；最后72℃终延伸10分钟。结果如图3所示，转基因番茄植株L1、L2和L3的PCR产物都在500 bp左右有特异性电泳条带，与NPTII报告基因大小一致，而非转基因番茄植株的PCR产物在相应位置没有出现电泳条带，证实转基因番茄植株L1、L2和L3均为转基因阳性植株。

六、转基因阳性植株中脂肪氧化酶家族基因的表达检测及脂肪氧化酶的活性分析

1、转基因阳性植株中脂肪氧化酶家族基因的表达检测

根据番茄TomloxA、TomloxB、TomloxC、TomloxD和TomloxE mRNA序列，设计如下特异引物：

TomA-df：5'- GAGGCGTGGGATAGGA-3'(SEQ ID No.12)；

TomA-dr：5'-GGATACGGGTAGTCAGCA-3'(SEQ ID No.13)；

TomB-df：5'-TGCTACAATGACTTGGGTGAA-3'(SEQ ID No.14)；

TomB-dr：5'-CCTGTCCTGCCTCTACG-3'(SEQ ID No.15)；

TomC-df：5'-ATGATCTCGGAGAAGTCG-3'(SEQ ID No.16)；

TomC-dr：5'-GTAGGGCGGAGTAAACG-3'(SEQ ID No.17)；

TomD-df：5'-GACAAGCAATAGCAGGAGTG-3'(SEQ ID No.18)；

TomD-dr：5'-TAAGTGTGCCAACATCAGAC-3'(SEQ ID No.19)；

TomE-df：5'-ATCTCAGTATCCGTATCCTCG-3'(SEQ ID No.20)；

TomE-dr：5'-TGTCCAAATCGCTCGTC-3'(SEQ ID No.21)。

同时以LeEF-1基因为内参基因，设计如下特异引物：

EF1-f：5'-GGAACTTGAGAAGGAGCCTAAG-3'(SEQ ID No.22)；

EF1-r：5'-CAACACCAACAGCAACAGTCT-3'(SEQ ID No.23)。

分别取前述转基因番茄阳性植株和非转基因番茄植株，提取总RNA，将总RNA反转录为cDNA，再以所得cDNA为模板，分别以TomA-df和TomA-dr、TomB-df和TomB-dr、TomC-df和TomC-dr、TomD-df和TomD-dr、TomE-df和TomE-dr为引物进行实时定量PCR，检测番茄脂肪氧化酶家族基因TomloxA、TomloxB、TomloxC、TomloxD和TomloxE在转基因植株中的表达。PCR体系为：模板1μL，上下游引物各0.5μL，SsoFast EvaGreen Supermix SYBR Green Master Mix 5μL；PCR循环参数为：98℃预变性3分钟；然后98℃变性2秒、56℃退火10秒、72℃延伸 30 秒，共40个循环。结果如图4所示，转基因番茄阳性植株L1、L2和L3中脂肪氧化酶家族基因TomloxA、TomloxB、TomloxC、TomloxD和TomloxE的表达都较非转基因番茄植株显著降低。

2、转基因阳性植株中脂肪氧化酶的活性分析

分别取前述转基因番茄阳性植株和非转基因番茄植株的叶各0.5g，除去中脉，按1g：2mL加入0.1%(w/w) Triton X-100(以0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)为溶剂)，低温机械破碎植物组织，10000rpm离心15分钟，取上清液，制得植物组织粗提液，利用流式细胞仪测得蛋白浓度。取60%(w/w)亚油酸0.4mL，加入10%(w/w) NaOH 0.5mL，用水定容至100mL，再取该溶液50mL，加入吐温20 0.25mL，用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)定容至250mL，制得底物。取底物2.8mL，加入前述植物组织粗提液0.2mL，混合均匀，计时，分别于第15秒和第30秒在波长234nm处测定OD值，根据公式A=4×[OD(30s)-OD(15s)]/0.01计算酶活性，其中A为活性单位数(U)，OD(30s)为第30秒的OD值，OD(15s)为第15秒的OD值。结果如表1所示，转基因番茄阳性植株L1、L2和L3中脂肪氧化酶的活性都较非转基因番茄植株显著降低。

表1  转基因阳性植株中脂肪氧化酶的活性分析

番茄植株脂肪氧化酶活性(U/mg蛋白)非转基因植株21.2087±1.3151转基因阳性植株L10.5210±0.0323转基因阳性植株L20.0738±0.0046转基因阳性植株L32.0202±0.1253

七、转基因阳性植株中不饱和脂肪酸的含量分析

分别取转基因番茄阳性植株和非转基因番茄植株所结的果实，测量果实中α-亚麻酸和亚油酸的含量。结果如表2所示，转基因番茄阳性植株L1、L2和L3所结果实中α-亚麻酸和亚油酸的含量都较非转基因番茄植株所结果显著增加。

表2  转基因阳性植株中不饱和脂肪酸的含量分析

番茄植株果实中α-亚麻酸含量(μg/mg)果实中亚油酸含量(μg/mg)非转基因植株97.28±27.8988.99±24.08转基因阳性植株L1160.70±17.77266.20±55.86转基因阳性植株L2388.42±63.22443.36±31.08转基因阳性植株L3223.99±47.69258.90±47.89

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110>  重庆大学

<120>  番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体及其构建方法和应用

<160>  24

 

<210>  1

<211>  371

<212>  DNA

<213>  番茄(Lycopersicon esculentumMill.)

<220> 

<223>  TomloxA基因开放读码框中第1350位至第1720位核苷酸

<400>  1  

atatgcctcg agaactttgc tattcttgca agataatgga tctttgaagc cactagcaat      60

tgaattgagt ttgccacatc cagatggaga tcaatttggt gttactagta aagtgtatac     120

tccaagtgat caaggtgttg agggctctat ctggcaattg gctaaagctt atgttgcggt     180

gaatgactct ggtgttcatc aactgattag tcattggttg aatacacatg ctgtgatcga     240

gccatttgtg attgcaacaa acaggcaact aagtgtgctt caccctattc ataagcttct     300

atatcctcat ttccgggaca caatgaatat taatgctttg gcaagacaga tcctaatcaa     360

tgctggtgga g     371

 

<210>  2

<211>  292

<212>  DNA

<213>  番茄(Lycopersicon esculentumMill.)

<220> 

<223>  TomloxC基因开放读码框中第455位至第746位核苷酸

<400>  2 

tagaaaatga gcaccacaag gaaatgtatg tgaaaaatat tgtaattgac ggttttgtcc      60

atgccaaagt tgaaattaca tgcaactctt gggttcattc caaatttgct aatcctgata     120

aaaggatttt cttcacaaat aagtcatatt taccatctca aaccccaagt ggagtaatta     180

ggttaagaga ggggagaact cgtacattaa gaggtgatgg agttggagaa agaaaagtat     240

ttgagaggat ttatgattat gatgtttata atgatctcgg agaagtcgtt ag        292

 

<210>  3

<211>  294

<212>  DNA

<213>  番茄(Lycopersicon esculentumMill.)

<220> 

<223>  TomloxD基因开放读码框中第1250位至第1543位核苷酸

<400>  3  

gacaagcaat agcaggagtg aacccagtgt ctatcgaaaa gcttcaggtt tttccaccag      60

taagcaagct tgatcctgaa atctatggcc ctcaagaatc cgccctcaag gaggagcaca     120

ttcttggtca tctcaatggc atgactgttc aagaggcttt ggatgcaaat aagcttttca     180

ttctggatca tcatgatgta tatctaccat ttctcgatcg gatcaatgca cttgatggcc     240

gcaaagcata tgcaacacgc accatttatt tcttgtctga tgttggcaca ctta       294

 

<210>  4

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物TomA-f

<400>  4  

ggtaccgcat gcatatgcct cgagaacttt gc    32

 

<210>  5

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物TomA-r

<400>  5  

ctcgaggata tcagatctct ccaccagcat tgattagg    38

 

<210>  6

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物TomC-f

<400>  6  

caccagatct ggatcctaga aaatgagcac cacaag    36

 

<210>  7

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物TomC-r

<400>  7  

gtcgctcgag gtcgacctaa cgacttctcc gagatc    36

 

<210>  8

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物TomD-f

<400>  8  

agatctgata tcctcgagga caagcaatag caggagtg    38

 

<210>  9

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物TomD-r

<400>  9  

gatcctctag ataagtgtgc caacatcaga c    31

 

<210>  10

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物NPTII-f

<400>  10  

gtcactgaag cgggaaggg    19

 

<210>  11

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物NPTII-r

<400>  11  

cggcgatacc gtaaagcac    19

 

<210>  12

<211>  16

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物TomA-df

<400>  12  

gaggcgtggg atagga    16

 

<210>  13

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物TomA-dr

<400>  13  

ggatacgggt agtcagca    18

 

<210>  14

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物TomB-df

<400>  14  

tgctacaatg acttgggtga a    21

 

<210>  15

<211>  17

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物TomB-dr

<400>  15  

cctgtcctgc ctctacg    17

 

<210>  16

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物TomC-df

<400>  16  

atgatctcgg agaagtcg    18

 

<210>  17

<211>  17

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物TomC-dr

<400>  17  

gtagggcgga gtaaacg    17

 

<210>  18

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物TomD-df

<400>  18  

gacaagcaat agcaggagtg    20

 

<210>  19

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物TomD-dr

<400>  19  

taagtgtgcc aacatcagac    20

 

<210>  20

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物TomE-df

<400>  20  

atctcagtat ccgtatcctc g    21

 

<210>  21

<211>  17

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物TomE-dr

<400>  21  

tgtccaaatc gctcgtc    17

 

<210>  22

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物EF1-f

<400>  22  

ggaacttgag aaggagccta ag    22

 

<210>  23

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物EF1-r

<400>  23  

caacaccaac agcaacagtc t    21

 

<210>  24

<211>  717

<212>  DNA

<213>  棕色固氮菌(Azotobacter Vinelandii)

<220> 

<223>  GFP基因开放读码框

<400>  24  

atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt      60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga     120

aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt     180

gtcactactt tctcttatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccagatca tatgaaacgg     240

catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc     300

aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt     360

aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa     420

ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga     480

atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac     540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac     600

ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt     660

cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaataa        717