谷氨酰胺抗鲤鱼红细胞凋亡作用及作用机制研究

摘要

本研究以幼建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)为试验模型，考察了谷氨酰胺(Gln)对幼建鲤生长性能、机体抗氧化能力和红细胞功能的影响。以建鲤红细胞为试验模型，研究了Gln及其代谢产物[丙氨酸(Ala)、瓜氨酸(Cit)和脯氨酸(Pro)]对羟自由基(·OH)诱导的鲤鱼红细胞凋亡的保护作用。探索了Gln影响鱼生长性能、机体抗氧化能力和红细胞功能的相关作用机制。本研究共包括5个试验：试验一：Gln对幼建鲤血液生化指标和红细胞功能的影响；试验二：·OH诱导鲤鱼红细胞凋亡模型的建立；试验三：·OH诱导鲤鱼红细胞凋亡途径的初步探索；试验四：Gln、Ala、Cit和Pro对·OH诱导的鲤鱼红细胞凋亡的保护作用；试验五：GJn、Ala、Cit和Pro对·OH诱导的鲤鱼红细胞凋亡途径的影响。　　试验方法和主要研究结果如下：　　1．Gln对幼建鲤血液生化指标和红细胞功能的影响　　本试验通过观测生长性能指标，抗氧化指标和红细胞功能指标以及血浆游离氨基酸含量，考察Gln对幼建鲤生长性能、机体抗氧化能力和红细胞功能的影响，为探索其作用机制提供依据。　　试验方法如下：试验选择400尾健康幼建鲤(初始鱼体重为6.08±0.03g)平均分成2组，每组设4个重复，每个重复50尾鱼，分别饲喂无Gln（对照组）和添加1.23%GJn的等氮日粮。试验期为56天。　　试验结果表明：与对照组相比，1.23% Gln组血浆、肝胰脏和肠道谷胱甘肽(GSH)含量显著升高(Jp＜0.05)，丙二醛(MDA)和蛋白质羰基(PC)含量显著降低（P＜0.05）。与对照组相比，1.23% GJn组红细胞比容(Hct)、血红蛋白(Hb)含量、红细胞数量(RBC)、平均单细胞体积(MCV)、平均单细胞血红蛋白含量(MCH)、红细胞乳酸脱氢酶(LDH)和Na+，K+-ATPase活性以及GSH浓度显著升高(P＜0.05)，红细胞MDA、PC和高铁血红蛋白(Met-Hb)含量显著降低(P＜0.05)。与对照组相比，1.23%Gln组血浆Gln、Ala、Cit和Pro含量显著升高(P＜0.05)。　　本试验结果说明：Gln提高了幼建鲤血浆中游离Gln、Ala、Cit和Pro含量，改善了机体抗氧化能力和红细胞功能。　　2．·OH诱导鲤鱼红细胞凋亡模型的建立　　本试验通过测定红细胞培养液中·OH浓度和Hb含量、红细胞死亡率、凋亡率和微核率以及DNA片段化发生的时间，考察·OH对鲤鱼红细胞凋亡和氧化损伤的诱导作用，选出·OH诱导红细胞凋亡的最适剂量和作用时间。　　试验方法如下：选用体重1OO-11Og左右健康建鲤，分离其红细胞，按1%(v／v)的浓度接种。试验采用单因子试验设计，试验共分为6个处理组，每个处理组4个重复，各处理组细胞培养液中Fe2+/H2O2的加入终浓度分别为0μM/0μM（对照组）、10 μM/5μM、20 μM/10 μM、30 μM/15 μM、 40μM/20μM、50 μM/25 μM，培养9小时后观察细胞形态和收集红细胞和培养液进行相关指标的测试分析。　　试验结果表明：与对照组相比，Fe2+/H2O2(10 μM/5 μM- 50 μM/25μM)组培养液中·OH浓度显著升高(P＜0.05)，而且·OH浓度与Fe2+/H2O2浓度呈显著正相关(r1=0.9995，P＜0.05); Fe2+/H2O2(10 μM/5 μM- 50 μM/25μM)组红细胞溶血率和死亡率也显著升高（P＜0.05），而且红细胞溶血率和死亡率与·OH浓度呈显著正相关(r1=0.8554,P＜0.05; r2= 0.8976,P＜0.05); Fe2+/H2O2(10μM/5μM- 40μM/20μM)组红细胞凋亡和微核水平显著高于对照组（P＜0.05）：而且红细胞凋亡和微核水平与·OH浓度呈显著正相关(r1=0.9245，P＜0.05; r2=0.9314，P＜0.05)。红细胞凋亡和微核水平在40 μM Fe2+/20 μM H2O2组最高。DNA电泳结果显示：40 μM Fe2 F/20μM H2O2组红细胞被孵育9小时出现180-200 bp的DNA片段组成的梯状条带。　　本试验建立了·OH诱导红细胞凋亡模型，诱导凋亡的适宜浓度和孵育时间分别为40 μM Fe2+/20μM H2O2.9小时；　　3.OH诱导鲤鱼红细胞凋亡途径的初步探索　　本试验通过测定不同成熟度鲤鱼红细胞ROS和Ca2+浓度、caspase-3和calpain活性和凋亡水平，考察了在?OH诱导情况下ROS、Ca2+、caspase-3和calpain是否参与了鱼类红细胞的凋亡，探索其的凋亡途径。　　试验方法如下：采用固定转头(30°)离心法将鱼红细胞分为早幼、中间和成熟二个细胞段。每段细胞分别进行试验，均分为4个处理组，每个处理组4个重复，4个处理组分别命名为：空白组、诱导组、抑制剂组和无钙组，试验条件分别为：含钙培养液(PCS)+0μM Fe2+/0μM H2O2、PCS+40 μM Fe2+/20 μM H2O2、PCS+40 μM Fe2+/20 μM H2O2+50 μM zVAD-fmk和无钙PCS+40 μM Fe2+/20 μM H2O2，37℃培养9小时后，收集红细胞进行相关指标的测试分析。　　试验结果表明：与空白组相比，诱导组凋亡细胞数、ROS和Ca2+水平、caspase-3和calpain活性显著升高(P＜0.05)。然而，抑制剂zVAD-fmk有效的抑制了·OH诱导的凋亡细胞数、ROS水平和caspase-3活性的提高；无钙PCS有效的抑制了·OH诱导的凋亡细胞数、Ca2+水平和calpain活性的提高。三段细胞均呈现相同的结果。对比三段细胞·OH诱导细胞凋亡的效果可以发现：早幼细胞段显著低于成熟细胞段，中间细胞处于二者之间，三段细胞均有显著差异：对比三段细胞zVAD-frnk对·OH诱导细胞凋亡的抑制效果可以发现：早幼细胞段显著高于成熟细胞段，中间细胞处于二者之间，三段细胞均有显著差异。对比三段细胞无钙PCS对·OH诱导细胞凋亡的抑制效果可以发现：早幼细胞段显著低于成熟细胞段，中间细胞处于二者之间，三段细胞均有显著差异。对比三段细胞·OH诱导细胞ROS水平和caspase-3活性升高的效果可以发现：早幼细胞段显著高于成熟细胞段，中间细胞处于二者之间，三段细胞均有显著差异；对比三段细胞zVAD-fmk对·OH诱导细胞ROS水平和caspase-3活性升高的抑制效果可以发现：早幼细胞段显著高于成熟细胞段，中间细胞处于二者之间，三段细胞均有显著差异。对比三段细胞·OH诱导细胞Ca2+水平和calpain活性升高的效果可以发现：早幼细胞段显著低于成熟细胞段，中间细胞处于二者之间，三段细胞均有显著差异；对比三段细胞无钙PCS对·OH诱导细胞Ca2+水平和calpain活性升高的抑制效果可以发现：早幼细胞段显著低于成熟细胞段，中间细胞处于二者之间，三段细胞均有显著差异。　　本试验结果说明：·OH诱导鲤鱼红细胞凋亡的途径有两条：一条为依赖于caspase的途径，一条为依赖于Ca2+的途径。不同成熟度的红细胞凋亡的主要途径存在差异，早幼红细胞凋亡途径更依赖于caspase活性，成熟红细胞凋亡途径更依赖于Ca2+水平。　　4. Gln、Ala、Cit和Pro对·OH诱导鲤鱼红细胞凋亡的保护作用　　本试验通过测定鲤鱼红细胞凋亡特征指标，考察Gln、Ala、Cit和Pro对?OH诱导鲤鱼红细胞凋亡的保护作用，通过测定培养液和红细胞氧化及抗氧化相关指标，考察Gln、AJa、Cit和Pro对·OH诱导鲤鱼红细胞凋亡所产生的氧化应激的影响，探索其抗凋亡作用机制。　　试验方法如下：试验共分为GJn、Ala、Cit、Pro及AJa、Cit和Pro混合物(Ala10Pro4Cit1)5个营养素处理组，每个处理组均分为8个处理，每个处理4个重复，8个处理细胞培养液中加入Fe2+/H2O2和各营养素的终浓度分别为0μM Fe2+/0 μMH2O2+0.00 mM营养素（空白处理）、40 μM Fe2+/20 μM H2O2+0.00 mM营养素（诱导处理）、40 μM Fe2+/20 μM H2O2+0.35 mM营养素、40 μM Fe2+/20 μM H2O2+0.70 mM营养素、40 μM Fe2F/20 μM H2O2+1.05 mM营养素、40 μM Fe2+/20μM H2O2+1.40 mM营养素、40 μM Fe2+/20μM H2O2+2.10 nM营养素、40μM Fe2+/20 μM H2O2+2.80 mM营养素，37℃培养9小时后，收集红细胞和培养液进行相关指标的测试分析。　　试验结果表明：与空白处理相比，诱导处理红细胞凋亡水平和氧化应激程度显著升高。然而，Gln、Ala、Pro、Cit和Ala10Pro4Cit1显著抑制了·OH诱导的红细胞凋亡，表现在：红细胞磷脂酰丝氨酸暴露、细胞体积缩小和DNA片段化水平的显著降低(P＜0.05)；显著抑制了由诱导凋亡而产生的红细胞氧化损伤，表现在：溶血率、细胞超氧阴离子(O2·-)和过氧化氢(H2O2)水平随营养素添加水平的升高而逐步降低(P＜0.05)，细胞抗·OH活性随营养素添加水平的升高而显著升高，红细胞MDA、PC和Met-Hb含量随营养素添加水平的升高而显著减少(P＜0.05)，和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽还原酶(GR)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活性以及GSH含量随营养素添加水平的升高而显著升高(P＜0.05)。结果还表明：Ala10Pro4Cit1抑制红细胞凋亡和氧化应激的效果显著高于Ala、Pro和Cit的单个效果不低于Gln的效果(P＜0.05)。　　本试验结果表明：Gln、Ala、Pro和Cit能抑制·OH诱导的鲤鱼红细胞凋亡，其抑制作用与其降低红细胞ROS的产生，减少细胞脂质和蛋白的氧化，以及恢复酶性和非酶性抗氧化能力有关；Gln的代谢产物Ala、Pro和Cit在抑制ROS产生、恢复酶性和非酶性抗氧化能力、降低脂质和蛋白的氧化以及提高鱼红细胞抗凋亡能力等方面具有协同效应。　　5．Gln、Ala、Cit和Pro对·OH诱导鲤鱼红细胞凋亡途径的影响　　本试验通过测定鲤鱼红细胞ROS和Ca2+浓度、caspase-3和calpain活性以及凋亡水平，考察Gln及其代谢产物对·OH诱导下鲤鱼红细胞凋亡途径的影响。　　试验方法如下：试验共分为空白、诱导、抑制剂、无钙、Gln、Ala、Cit、Pro及Ala10Pro4Cit1 9个处理组，每个处理组4个重复。9个处理组细胞培养液中各添加物质的终浓度分别为：0（空白处理组）、40 μM Fe2+／20 μM H2O2（诱导处理组）、40 μMFe2+/20 μM H202+50 μM zVAD-fmk（抑制剂处理组）、无钙PCS+40 μM Fe2+/20 μMH2O2（无钙处理组）、40 μM Fe2+／20 μM H2O2+1.40 mM Gln、40 μM Fe2+/20 μMH2O2+1.40 mM Ala、40 μM Fe2+/20 μM H2O2+1.40 mM Cit、40 μM Fe2+/20 μMH2O2+1.40 mM Pro、40 μM Fe2+/20 μM H2O2+1.40 mM Ala10Pro4Cit1, 37℃培养9小时后，收集红细胞进行相关指标的测试分析。　　试验结果表明：与空白处理相比，诱导处理红细胞ROS和Ca2+浓度、caspase-3和calpain活性以及凋亡水平显著升高。然而，Gln、Ala、Pro、Cit和Ala10Pro4Cit1显著抑制了细胞ROS和Ca2+水平、caspase-3和calpain活性以及凋亡水平的升高(P＜0.05); zVAD-fmk显著抑制了细胞ROS水平、caspase-3活性和凋亡水平的升高(P＜0.05)：无钙PCS显著抑制了细胞Ca2+水平、calpain活性和凋亡水平的升高。Ala10Pro4Cit1抑制细胞ROS和Ca2+水平、caspase-3和calpain活性和凋亡水平升高的效果显著高于Ala、Pro和Cjt的单个效果(P＜0.05)。　　本试验结果说明：Gln、Ala、Pro和Cit通过抑制Ca2+途径和caspase途径抑制鲤鱼红细胞凋亡；同摩尔浓度的Ala、Pro和Cit三种氨基酸协同作用下抑制红细胞凋亡方面的效果与Gln相当。　　综上，Gln能够提高幼建鲤生产性能、机体抗氧化能力和红细胞功能。Gln提高了血液中Gln、Ala、Cit和Pro含量。Gln及其代谢产物(Ala、Cit和Pro)显著抑制了·OH诱导的鲤鱼红细胞凋亡和氧化损伤。Gln及其代谢产物(Ala、Cit和Pro)抑制了·OH诱导的红细胞ROS含量的升高、细胞成分的氧化、细胞酶和非酶抗氧化剂活性的降低,并且抑制了凋亡诱导因子(ROS)、第二信使(Ca2+)以及凋亡通路中关键酶(caspase和calpain)的活性,这是其抑制红细胞凋亡的重要原因。Gln代谢产物(Ala、Cit和Pro)的抗凋亡和抗氧化活性并不低于Gln、Ala、Pro和Cit在抑制细胞凋亡和氧化应激上具有协同效应。

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