重组人RGD-sTRAIL的基因克隆、表达、纯化及肿瘤靶向性研究

摘要

目的 构建、表达融合有RGD短肽序列的人肿瘤坏死因子凋亡配体(RGD-sTRAIL)表达载体,表达产物RGD-sTRAIL经纯化后检测其体外抑瘤活性以及研究体内对肿瘤组织部位的靶向作用.方法用PCR方法扩增融合有RGD序列的hTRAIL的114-281位氨基酸的cDNA,扩增产物与质粒载体pGEM3Zf(-)连接,构建克隆载体pGEM-RGD-sTRAIL.在宿主菌DH5 α中扩增重组质粒,由蓝白菌落筛选的方法挑取阳性克隆提取质粒并由限制性内切酶酶谱分析、DNA序列分析两种方法进行鉴定正确后进行酶切回收目的RGD-sTRAIL DNA片段,将目的基因插入pET-lla中构建成表达载体,再次转化大肠杆菌BL21,挑取单菌落提取质粒进行PCR鉴定.鉴定后的阳性克隆用IPTG进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和免疫学鉴定正确后,纯化包涵体,进行蛋白的变性、复性,复性后蛋白再经离子交换和分子筛进行纯化,得到纯品RGD-sTRAIL,薄层扫描仪扫描凝胶以检测纯度.纯化产物RGD-sTRAIL蛋白以不同浓度处理人肺癌细胞系A549,观察细胞的形态变化并用结晶紫染色法检测RGD-sTRAIL的体外抗肿瘤活性.将纯化后的RGD-sTRAIL和TRAIL蛋白分别经尾静脉注射导入荷瘤小鼠体内,不同时段后处死动物后取肿瘤部位组织,通过免疫组织化学的方法观察目的蛋白在肿瘤部位的分布.结论成功构建重组RGD-sTRAIL表达载体,并在大肠杆菌中获得表达,成功获得包涵体复性后的纯化蛋白.复性纯化后的重组蛋白RGD-sTRAIL能明显抑制人肺癌细胞A549生长,并呈剂量依赖性.RGD-sTRAIL在体内具有肿瘤靶向的特性.

目录

英文缩略词表

引言

参考文献

第一部分：重组人RGD-sTRAIL(114-281)基因的克隆、表达及纯化

1.引言

2.材料与方法

2.结果

4.讨论

5.小结

参考文献

第二部分：重组人RGD-sTRAIL在体外抗肿瘤活性及体内肿瘤靶向的研究

1.引言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

5.结论

6.小结

参考文献

对课题的进一步设想

简历

致谢

硕士研究生期间所承担的课题和发表的论文

综述：α V整合素抑制剂与癌症治疗