研究之一人抵抗素基因cDNA克隆;目的获取中国汉族人抵抗素(resistin)基因的克隆质粒,为进一步研究抵抗素基因提供物质基础.方法按RNeasy Mini Kit操作说明从网膜脂肪组织提取总RNA,凝胶电泳鉴定总RNA质量,紫外分光光度法检测总RNA的纯度和浓度;根据报道的人resistin基因序列(GI:14211896),用计算机软件设计特异性引物,以总RNA为模板,通过RT-PCR的方法逆转录合成完整resistin基因cDNA,扩增产物进行凝胶电泳分析并BamHI酶切鉴定;经QIAquick Gel Extraction Kit凝胶回收纯化,再A-T连接到载体PMD18T载体,重组质粒转化JM109感受态菌,蓝白斑筛选阳性菌落,再摇菌扩增,QIAprep Spin Miniprep Kit抽提质粒;最后EcoRI、HindⅢ酶切鉴定后,进行核苷酸序列分析.结果总RNA电泳清晰显示28S、18S、5S三条带,28S/18S约2:1,A<,260>/A<,280>=1.9,表明提取的总RNA纯度高,其浓度为1μg/μ1;RT-PCR产物经凝胶电泳后于紫外分析仪下可见在250bp与500bp之间有唯一清晰的条带,和扩增目的基因片段的理论长度363bp一致;RT-PCR产物经BamHI内切酶切后得到两条带,片段大小分别与理论值239bp与124bp相符,进一步证明扩增目的片段的正确性;重组质粒pMD18-T-RETN经EcoRI和HindⅢ内切酶双酶切后也为两条带,其大小与pMD18-T-RETN经上述双酶切后所得到片段理论长度2635bp与420bp一致,说明RT-PCR产物准确插入pMD18-T载体.核苷酸序列分析的碱基序列与Genbank报道基本一致,仅第23氨基酸位由Ser(TCC)变成Phe(TTC).结论成功克隆中国汉族人resistin基因cDNA.研究之二人抵抗素基因mRNA在肥胖症脂肪组织中的表达;目的观察抵抗素(resistin)基因在中国汉族人腹部皮下和网膜脂肪组织中的表达及其与空腹血浆葡萄糖(FPG)、血浆胰岛素(FINS)、血脂、胰岛素敏感指数(ISI)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和体重指数(BMI)、腰臀比(WHR)的相关性.方法从网膜脂肪组织提取总RNA,以肌动蛋白(β-actin)基因作为内参照,通过半定量RT-PCR的方法检测19名肥胖症(BMI≥25Kg/m<'2>)腹部皮下和网膜脂肪组织抵抗素的表达量,采用29名非肥胖(BMI<25Kg/m<'2>)作对照,同时检测空腹血浆胰岛素、空腹血浆葡萄糖和血脂水平.结果1.腹部皮下和网膜脂肪组织的抵抗素基因mRNA表达量的比较,肥胖组与正常组之间差异均无统计学意义(P>0.05);肥胖组内腹部皮下和网膜脂肪组织的的差异也无统计学意义(P>0.05);2.腹部皮下和网膜脂肪组织的抵抗素基因mRNA表达量与其他因素均无关联(P>0.05);多元逐步回归分析显示,腹部皮下脂肪组织抵抗素基因mRNA表达量和网膜脂肪组织相关(β=0.283,R<'2>=0.061,P=0.05)3.肥胖组血浆胰岛素水平明显高于正常组(P<0.01),胰岛素敏感指数(ISI)明显低于正常组(P<0.05).胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)与体重指数(BMI)、腰臀比(WHR)正相关(r=0.385,P=0.007;r=0.356,P=0.013).结论抵抗素基因在肥胖与正常体重人群脂肪组织中表达无明显差异,脂肪组织中的抵抗素表达水平与胰岛素抵抗(IR)无关,体重指数可能是胰岛素抵抗的一个明显的预警信号.
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