G蛋白偶联受体激酶在胶原性关节炎大鼠滑膜细胞信号转导中的作用及白芍总苷和芍药苷对其的影响

摘要

目的：观察胶原性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠炎症过程中滑膜组织G蛋白偶联受体激酶(G-protein-coupled receptor kinases,GRKs)的表达情况及白芍总苷(total glucosides of paeony,TGP)对其的影响;明确GRKs在CIA大鼠成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)中的表达情况及TGP中有效单体成分芍药苷(paeoniflorin，Pae)对其的影响。从滑膜细胞G蛋白偶联信号途径，研究GRK2在FLS的信号调节中作用及Pae治疗大鼠CIA的可能的分子机制。 方法：大鼠足趾、尾根部、背部皮内多点注射鸡Ⅱ型胶原(chicken type Ⅱcollagen，CCII)乳剂制备CIA模型，TGP(25、50、100 mg·kg-1·d-1)灌胃给药(intragastricadministration，ig)(d14～d28)，观察大鼠全身状况及足爪肿胀度，光学显微镜观察关节病理变化；Western blot检测GRKs水平。组织块法培养大鼠关节滑膜细胞，微孔生物发光法检测FLS PKA活性，放免法检测FIS cAMP水平。 结果： 1.CIA大鼠关节滑膜组织GRKs的表达及TGP对其的影响CIA大鼠加强免疫注射后28天左右炎症反应达到高峰，光镜下可见滑膜组织中滑膜细胞增生明显，层次增多，排列紊乱，滑膜下层纤维组织增生，血管扩张、充血，炎性细胞浸润及血管翳形成，软骨中炎性细胞浸润，破坏软骨组织。Westernblot发现CIA大鼠滑膜组织中GRK2、GRKs、GRK6的表达较正常组明显升高，致炎后28天GRK2、GRK5、GRK6的表达达到高峰；46天后关节肿胀、炎症逐渐减退，GRK2、GRK5、GRK6的高表达也开始下降。TGP(25、50、100 mg·kg-1)可明显减轻CIA大鼠的足爪肿胀度，改善其多发性关节炎症状，可不同程度改善以上病理变化。TGP(25、50、100 mg·kg-1)可以降低CIA大鼠滑膜组织GRKs、GRK6的高表达水平；TGP(100 mg.kg-1)给药后CIA大鼠滑膜组织GRK2的表达水平明显降低。 2.GRKs在CIA大鼠滑膜细胞中的表达及Pae对其的影响CIA大鼠滑膜细胞GRK2、GRK5、GRK6表达水平升高，Pae(10-5、10-6、10-7、10-8moI·L-1)可以不同程度的降低CIA大鼠滑膜细胞GRK2、GRK5、GRK6的表达。 3.GRK2与G蛋白·AC-cAMP信号通路的关系及Pae对其的影响加入GRK2抑制剂(5-甲基［2-(5-硝基-2-呋喃基)乙烯基］-2-糠酸酯,C12H9NO6)后，滑膜细胞cAMP的水平和PKA的活性升高；Pae(10-5、10-6、10-7、10-8mol·L-1)可以降低GRK2抑制剂引起的滑膜细胞cAMP水平的升高，Pae(10-5、10-6mol·L-1)可以降低GRK2抑制剂引起的滑膜细胞PKA活性的升高。 结论： 1.CIA炎症导致关节滑膜组织和滑膜细胞GRK2、GRK5、GRK6表达水平的上调；GRKs是CIA滑膜炎症、滑膜细胞异常增殖的重要分子。 2.TGP对大鼠CIA多发性关节炎、关节局部肿胀及病理形态等具有明显的改善作用；TGP、Pae可以下调CIA大鼠关节滑膜组织和滑膜细胞GRKs的高表达；而且Pae可以纠正GRK2抑制剂引起的CIA大鼠滑膜细胞脱敏障碍，恢复G蛋白-AC-cAMP信号通路的正常转导。提示TGP、Pae下调GRKs的表达，抑制GPCRs的过度脱敏，调节G蛋白-AC-cAMP信号通路的正常转导，可能是其抑制滑膜细胞增殖、维持滑膜正常功能的重要机制之一。

目录

论文说明：英文缩略词对照

声明

摘要

1前言

2实验材料

2.1动物

2.2药物和试剂

2.3仪器与设备

3实验方法

3.1大鼠CIA模型的诱导

3.2分组及给药

3.3足爪肿胀度测量

3.4病理组织学检查

3.5滑膜细胞的组织块培养

3.6蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测滑膜组织和滑膜细胞GRKs表达

3.6.1大鼠滑膜组织样品制备及蛋白质提取

3.6.2大鼠滑膜细胞样品制备及蛋白质提取

3.6.3蛋白定量（Lowry法）

3.6.4 Western-blot操作步骤

3.7滑膜细胞cAMP含量测定

3.8滑膜细胞PKA活性测定

3.9统计学处理

4.结果

4.1 CIA大鼠GRKs表达的变化

4.1.1 CIA大鼠关节肿胀度的变化

4.1.2 CIA大鼠关节滑膜组织GRK2、GRK5、GRK6表达的变化

4.2 TGP对CIA大鼠的治疗作用及对GRKs表达的影响

4.2.1 TGP对CIA大鼠的治疗作用

4.2.2 TGP体内用药对CIA大鼠关节滑膜组织GRK2、GRK5、GRK6蛋白表达的影响

4.3 GRK2抑制剂对CIA大鼠关节滑膜细胞G蛋白-cAMP-PKA信号途径的影响及芍药苷(Pae)的作用

4.3.1滑膜细胞培养

4.3.2 Pae体外用药对CIA大鼠关节滑膜细胞GRK2，GRK5，GRK6表达的影响

4.3.3 GRK2抑制剂对CIA大鼠滑膜细胞cAMP的影响及Pae的作用

4.3.4 GRK2抑制剂对CIA大鼠滑膜细胞PKA活性的影响及Pae的作用

5讨论

5.1 GRKs是与类风湿关节炎(RA)滑膜细胞增殖相关的重要分子

5.2 TGP、Pae下调GRKs的表达，抑制GPCRs的过度脱敏，调节G蛋白-AC-cAMP信号通路的正常转导可能是其抑制滑膜细胞增殖，维持滑膜细胞正常功能的重要机制之一

6.结论：

参考文献

个人简历

致谢

综述 G蛋白偶联受体激酶的调控及其与类风湿关节炎有关的药物靶点