rIL-1α对胶原性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞前列腺素E2受体及G蛋白偶联信号转导的影响和白芍总苷的作用

摘要

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的慢性自身免疫性和损伤性关节炎,最终导致进行性关节损伤.RA的显著特征是慢性滑膜炎、关节软骨和骨组织的损伤以及系统性炎症的发生。滑膜细胞在白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)的刺激下处于高分泌状态,产生更多细胞因子,这些细胞因子相互作用,刺激滑膜细胞过度增生形成血管翳,是引起RA患者软骨和骨组织损伤的主要原因。迄今为止,RA的发病机制还没有明确。虽然用于治疗RA的药物较多,但由于用药的持久性和副作用,目前尚无理想的治疗RA药物。白芍总苷(total glucosides of paeony,TGP)是从中药芍药(paeonia lactiflora Pall)中提取的有效部位,主要成份是芍药苷,是已经被证实为有效治疗RA的传统中药。然而,TGP如何发挥治疗慢性系统性疾病如RA的机制还不清楚。鸟苷酸结合蛋白(G-protein-coupled receptors,G-protein),简称G蛋白,其介导的信号转导通路在免疫性疾病中发挥重要作用。PGE2作为RA发病中重要的炎性介质之一,通过结合并激活细胞膜上的PGE2受体(prostaglandins E2 receptors,EP)引起一系列生理和病理作用,已知EP是G蛋白偶联受体,激活的EP引发G蛋白活化及其下游信号传递,如环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)水平的变化。本研究采用大鼠胶原性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型,探讨了TGP对CIA大鼠继发性关节肿胀度、滑膜细胞分泌功能和增殖能力的影响。另外,本实验以滑膜细胞为实验对象,阐明TGP对重组大鼠白细胞介素1α(recombinant rat IL-1α,rIL-1α)作用下CIA大鼠成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)EP受体的表达和G蛋白信号通路的影响。
　　目的:
　　阐明TGP对CIA大鼠FLS功能的影响。实验通过观察TGP对FLS产生PGE2、TNF-α和cAMP的作用,阐明TGP对滑膜细胞增殖和细胞因子之间相互作用的影响;分析TGP是否通过PGE2-EP-G蛋白-cAMP信号转导通路调节cAMP水平、抑制滑膜细胞增殖和抑制炎性细胞因子的水平发挥治疗CIA作用。
　　方法:
　　大鼠左后足趾、尾根部、背部皮内多点注射鸡Ⅱ型胶原(chicken typeⅡcollagen,CⅡ)乳剂制备CIA模型,以TGP(25,50,100mg·kg-1,ig,d14~d28)治疗给药,GTW(40mg·kg-1,ig,d14~d28)作为阳性对照。正常组和模型组给予等体积的羧甲基纤维素钠溶液。
　　足容积法测量大鼠继发侧(右后)足爪肿胀度(Δml);ELASA法检测大鼠血清中抗CⅡ抗体的水平。MTT法检测滑膜细胞的增殖反应;放射性免疫法测定PGE2、TNF-α和cAMP的水平。采用Western blot技术检测滑膜组织Gαi2蛋白表达和FLS膜蛋白EP受体亚型EP4蛋白表达。
　　结果:
　　1、TGP减轻CIA大鼠继发性关节肿胀度、抑制滑膜细胞过度增殖和分泌过多炎性细胞因子
　　以致炎前右后足爪的足爪容积作为d0,致炎后每隔4d测量一次。同正常组大鼠相比较,d14 CIA大鼠继发侧足爪肿胀度显著增加, d22~d26达高峰。TGP(25,50,100mg·kg-1,d14~d28)可显著减轻CIA大鼠的足爪肿胀度。体内实验结果表明,TGP(25,50,100mg·kg-1, d14~d28)明显抑制滑膜细胞增殖和分泌IL-1、PGE2和TNF-α的能力。
　　2.TGP抑制rIL-1α作用下CIA大鼠FLS分泌PGE2和TNF-α的水平
　　细胞因子如IL-1、TNF-α和PGE2在RA发病机制中发挥重要作用。体外试验中,以FLS为观察对象,选择rIL-1α为体外刺激因子,观察rIL-1α对FLS分泌TNF-α和PGE2的影响。rIL-1α呈浓度/时间依赖性的提高FLS分泌TNF-α和PGE2水平,TGP(2.5,12.5,62.5,125,250μg·ml-1)不同程度的降低PGE2和TNF-α水平,呈明显的量效关系。体外9实验进一步证实了TGP对CIA大鼠FLS分泌功能的影响。
　　3.TGP调节炎性因子介导的G蛋白信号转导通路是TGP抑制滑膜细胞过度分泌功能的重要分子机制之一。
　　众多文献报导EP受体亚型EP4参与RA的病理生理学过程。本课题中,Western blot法检测结果发现,TGP升高EP4蛋白表达,抑制Gαi2的蛋白表达,上升cAMP水平,抑制滑膜细胞增殖。提示TGP恢复PGE2-EP-G蛋白-cAMP信号转导的正常通路,可能是其抑制CIA大鼠FLS亢进分泌功能的重要分子机制之一。
　　结论:
　　1.TGP对大鼠CIA关节局部肿胀有明显改善作用;TGP抑制滑膜细胞过度增殖、降低滑膜细胞分泌PGE2、TNF-α和IL-1。
　　2.TGP抑制rIL-1α诱导的CIA大鼠FLS分泌PGE2和TNF-α是其抑制滑膜细胞亢进分泌功能的重要特点。
　　3.TGP调节PGE2-EP-G蛋白-cAMP信号转导平衡可能是其恢复CIA大鼠FLS功能和抑制其亢进分泌功能的重要分子机制之一。

目录

目录

中文摘要

英文摘要

1 前 言

2 实验材料

2.1 动物

2.2 药物

2.3 试剂

2.4 仪器

3 实验方法

3.1 大鼠 CIA 模型的制备[10]

3.2 分组及给药

3.3 关节肿胀度测定

3.4 血清抗CⅡ抗体的检测

3.5 滑膜细胞的培养

3.6 滑膜细胞的增殖反应

3.7 滑膜细胞上清液中 TNF-α、IL-1 和 PGE2水平的测定

3.8 滑膜细胞 cAMP 水平的测定

3.9 CIA 大鼠 FLS 产生 PGE2、TNF-α 和 cAMP 的水平检测

3.10 Western blot 法检测滑膜组织 Gαi2 和 FLS EP4受体蛋白的表达

3.11 统计学处理

4 结 果

4.1 TGP 对 CIA 大鼠血清抗 CⅡ抗体的影响

4.2 TGP 对 CIA 大鼠继发侧足爪肿胀度的影响

4.3 TGP 体内给药对滑膜细胞分泌 PGE2、TNF-α 和 IL-1 的影响

4.4 TGP 体内给药对滑膜细胞增殖反应和cAMP水平的影响

4.5 TGP 对 FLS 产生 PGE2、TNF-α 和 cAMP的影响

4.6 TGP 对 CIA 大鼠滑膜组织 Gαi2 蛋白表达的影响

4.7 TGP 对 CIA 大鼠 FLS EP4蛋白表达的影响

5 讨 论

5.1 TGP 抑制 CIA 大鼠继发性关节肿胀度，抑制滑膜细胞过度增殖和亢进的分泌功能

5.2 TGP 抑制 rIL-1α 作用下 CIA 大鼠 FLS 分泌 PGE2和 TNF-α是其抑制滑膜细胞亢进分泌功能的重要特点

5.3 TGP调节炎性因子介导的 G蛋白信号转导通路是 TGP 抑制滑膜细胞过度分泌功能的重要分子机制之一

6 结 论

参考文献

附录

致谢

综述：类风湿关节炎中PGE2与IL-1关系及其药物作用