用大鼠原代心肌细胞在体外构建工程化心肌组织的实验研究

摘要

研究背景：终末期缺血性心脏疾病的治疗是目前临床上尚未克服的难题之一。在我国，随着人们生活水平的提高，冠心病等的发病率呈现逐年上升的趋势，寻找到一个能够有效地纠正因为心肌梗死造成的心力衰竭、猝死等严重后果的治疗方法，业已成为近年来临床科研工作的重点。而由心肌梗死等原因造成的终末期缺血性心脏疾病的根本原因是有功能的心肌细胞数量的减少，因此如何恢复或增加有功能心肌细胞的数量就成为科研的出发点。为此，人们首先想到了使用细胞移植的方法，通过局部种植或血管灌注等途径将体外培养的心肌细胞移植到心梗区域，恢复功能心肌细胞的数量，现己进入Ⅰ期临床实验阶段。但到目前为止细胞移植还面临着很多的问题，首先是种植的细胞存活率较低，与宿主组织的融合性较差，存活下来细胞的实际功能还值得怀疑，因此它的临床实用价值尚有待观察。为了克服这些缺点，近年来发展起来的利用组织工程学的方法构建工程化的心肌组织(engineering heart tissue，EHT)替代坏死的心肌组织，恢复心脏的功能被认为是给终末期缺血性心脏疾病的治疗带来了希望。组织工程学(tissueengineering，TE)是继遗传工程学之后新近发展起来的一门新兴的应用科学，是研究开发用于修复和改善损伤组织结构和功能的生物替代物的一门科学。其核心是模拟体内组织发生的环境，建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体，其发展将会对现代医学的基本原则带来深远而有意义的影响。它通过应用细胞生物学技术和材料工程学方法在体内和体外进行组织和器官的构建，即将获得的少量自体细胞在体外进行扩增后，再将这些细胞与具有较强生物可容性和生物可降解性的人工合成共聚物混合，从而形成细胞—支架复合物。而这些共聚物可使细胞在特定的位置种植、固定并生长，为组织的形成提供模板。同时，这种细胞—支架复合物无免疫原性，且拥有和自体组织类似的结构和功能，因此被认为具有广泛的应用前景。目前实验已经对不同组织，包括骨、软骨、肌腱、皮肤，血管和角膜等进行了成功的构建，并已经被临床用于修复多种组织缺损，取得了令人满意的效果。组织工程学在心脏外科亦有着广泛的应用前景，包括构建工程化心肌组织、工程化心脏瓣膜、工程化血管等均成为研究的目标，其中对工程化心脏瓣膜的研究已取得积极的进展，但在工程化心肌组织构建方面的研究才刚刚起步，还面临着一系列的问题。首先是种子细胞的选择，如何获取纯度较高的心肌细胞，还需从各种种子细胞中进行筛选；其次是支架材料的选择，目前应用的材料在生物力学特性上还不能满足临床使用的要求，还无法承受左心室巨大压力的冲击，因此还有待进一步的研究和改进。本实验将就EHT的体外构建进行初步的探讨。目的探讨用大鼠原代心肌细胞和生物可降解材料聚乙醇酸/聚乳酸共聚物(polyglycolic acid and polylactic acid，PLGA)在体外构建工程化心肌组织的可行性。 方法：用0.125％胰蛋白酶和0.01％的EDTA从新生大鼠心脏组织中消化分离出心肌细胞进行体外培养；用多聚L-赖氨酸(PLL)对支架材料PLGA进行修饰，将具有活力的心肌细胞种植于PLGA上并使其固定、生长，构建工程化心肌组织片。应用免疫组织化学和RT-PCR的方法进行心肌细胞鉴定和检测，并应用扫描电子显微镜对细胞-支架复合物进行结构扫描，以及HE染色的方法观察细胞生长及其与材料的融合情况。 结果：分离后的原代心肌细胞在DMEM营养液中贴壁生长良好，细胞存活率在93％以上，并且具有自发搏动的能力，以5—14d左右时间内活力最强；利用细胞差时贴壁的原理并在培养液中加用5-Brdu后，心肌细胞纯度可达95％以上，并保持有一定的增殖能力。细胞免疫组织化学鉴定α-肌动蛋白(α-Actin)和结蛋白(Desmin)均呈阳性表达，RT-PCR检测到心肌细胞特异性基因GATA-4和Nkx2.5的表达。在多聚L-赖氨酸的修饰作用下，原代心肌细胞能够在支架材料PLGA上种植、固定并生长。HE染色及电镜扫描观察均见心肌细胞沿支架材料纤维附着生长，分布均匀，相互融合。 结论：原代心肌细胞可以作为组织工程学研究的种子细胞，它能够在聚酯类支架材料上种植、固定并生长，在体外成功构建工程化的心肌组织，为终末期缺血性心脏疾病的临床治疗带来希望。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

实验材料

实验方法

结果

讨论

结论

参考文献

附录

综述 工程化心肌组织体外构建研究进展