实时荧光PCR技术检测乙型肝炎病毒YMDD变异和乙型肝炎病毒基因型方法的建立及应用

摘要

实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)是近年来兴起的、已经成为分子生物学重要技术之一。实时荧光定量PCR是指在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线来对未知模板进行定量分析的方法。借助荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面可以在每次PCR循环收集数据，建立实时扩增曲线，准确地确定域值循环数(CT值)，计算起始拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。由于PCR的扩增和产物分析过程都在一封闭的管中进行，较之传统的PCR方法大大减少了污染的几率，因此荧光定量PCR具有特异、快速、敏感、准确、线性范围宽，操作简便安全，且无PCR后处理。该方法又根据荧光标记的不同，分为荧光染料法和荧光探针法。荧光探针法又根据探针设计的不同原理分为5'核酸酶探针(5'Nuclease(TaqMan)Probes)，分子信标(molecular beacon)和FRET杂交探针(FRET hybridizationprobe)。TaqMan探针的实时荧光定量PCR是本课题的主要研究对象，本论文报道应用选择引物的原理建立TaqMan探针的实时荧光定量PCR方法用于LAM治疗HBV过程中的YMDD变异的点突变监测以及TaqMan探针的实时荧光定量PCR方法用于乙型病毒基因型的检测。 第一部分选择引物的TaqMan探针的实时荧光定量PCR用于LAM疗HBV过程中的YMDD变异的点突变监测方法建立拉米夫定(Lamivudine，LAM)是目前公认的最有效而安全的抗病毒的核苷类似药物，但长期使用可诱发HBV病毒变异，引起病毒耐药。酪氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)功能区变异是HBV拉米夫定耐药的主要原因。 近年来国内外学者采用许多方法进行YMDD变异，如测序、线性探针分析[6]、基因芯片[7]、PCR-肽核酸[8]、聚合酶链反应限制性片段长度多态性[9]，和通用模板PCR[10]等方法。鉴于我国医疗机构实验室开展实时荧光PCR检测十分普遍，这些实验室都拥有荧光定量PCR分析仪，故此本文针对该类仪器，采用选择性引物和TaqMan探针技术，建立了一种新的适应这类设备的实时荧光PCR方法。我们用此方法检测187例临床乙肝患者血清标本，观察HBV的YMDD变异情况，同时用测序法作为金标准比对验证。结果证明，此方法在临床YMDD变异诊断中具有快速、灵敏和特异的特点。第二部分应用TaqMan探针的实时荧光定量PCR方法用于乙型肝炎病毒基因型的检测应用TaqMan探针的实时荧光定量PCR方法对150例HBV样本进行HBVDNA定量检测和分型检测，然后对其中载毒量大于5000IU/ml的113例标本和一例进行测序分型检测。对于通过PCR测序方式获得的114例样本的DNA序列，全部使用NCBI在线分型工具(www.ncbi.nlm.ni.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)进行DNA序列的比对、分析.进行HBV基因分型。验证了该方法能快速对乙型肝炎病毒B基因型、C基因型以及B、C混合基因型进行检测，有良好的特异性和极高的符合率，具有较大的临床意义。 总结： 总之，荧光定量PCR具有特异、快速、敏感、准确、线性范围宽，操作简便安全等许多优势。它在化学和生物化学分析领域具有很大的潜力，尤其在临床医学检验领域，作为一种新兴、快速有效的检测方法将会得到快速应用和发展。

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论文说明：缩略词表

声明

摘要

前言

第一部分：选择引物的TaqMan探针的实时荧光定量PCR用于LAM治疗HBV过程中的YMDD变异的点突监测方法建立

1实验原理

2材料与方法

3实验结果

4讨论

5结论

参考文献

第二部分：应用TaqMan探针的实时荧光定量PCR方法用于乙型肝炎病素基因型 的检测

1实验原理

2材料与方法

3实验结果

4讨论

5结论

参考文献

附录：个人简历

致谢

综述：乙肝病毒拉米夫定治疗病毒YMDD变异检测的研究进展