辅助病毒依赖型腺病毒载体转基因的体外表达效率

摘要

目的：辅助病毒依赖型腺病毒载体（HDAd）主要用于基因治疗的研究，目前仅有两篇关于HDAd 作为系统疫苗载体的研究报道，与第一代腺病毒载体或复制缺陷型腺病毒载体（FGAd）相比，发现HDAd 可引起机体产生针对转基因的更强的细胞免疫和体液免疫反应。一般认为这种增强的免疫应答主要与HDAd 能在体内高表达转基因及减弱的载体反应有关，关于这两种载体体外转基因表达情况的研究较少。绿色荧光蛋白（GFP）因其可在异源组织中稳定发出荧光、所产生的荧光不需要任何物质的辅助、不影响宿主等特性得到了广泛应用，增强型绿色荧光蛋白（EGFP）是经过密码子优化及氨基酸突变等一些列基因改造后获得的GFP 突变体，发出的荧光比GFP更强、更易观察，成为比GFP应用更广泛的报告基因。为比较这两种载体的体外表达效率，我们构建了可表达EGFP的HDAd （HDAd/EGFP）并完成大量制备、纯化和体外表达鉴定；同时与可表达EGFP的FGAd （FGAd/EGFP）进行了体外感染和转基因表达效率的比较研究，为进一步的体内免疫效果和免疫保护作用研究奠定基础。
　　 方法：通过PCR获得带有CMV启动子、EGFP开放读码框（Open reading frame,ORF）和SV40多聚腺甘酸序列的EGFP表达盒，先后克隆至HDAd 穿梭质粒pSC11及HDAd 骨架质粒pSC15B，构建pSC15B/EGFP 重组质粒。Pme Ⅰ消化pSC15B/EGFP 获得线性化片段，经磷酸钙共沉淀法转染293Cre4细胞，16 h 后感染辅助病毒H14，收获HDAd/EGFP 粗提液，随后以HDAd/EGFP 粗提液及辅助病毒连续共感染293Cre4细胞直至HDAd/EGFP 达到复制极限。大量制备HDAd/EGFP，CsCl 超速离心纯化，荧光显微镜和电镜下观察纯化后的HDAd/EGFP。使用分光光度计法测定纯化的病毒颗粒数（virus particle，vp），分别用约2000 vp/细胞的HDAd/EGFP和FGAd/EGFP 感染A549细胞，通过相同时间点流式细胞仪分析EGFP的表达情况。
　　 结果：成功构建可表达EGFP的HDAd/EGFP 载体，通过与辅助病毒共感染293Cre4细胞及CsCl 梯度法超速离心制备了大量纯化的HDAd/EGFP。纯化后体外感染293Cre4细胞，荧光显微镜下观察到EGFP的表达；电镜观察可见典型的腺病毒颗粒。以相同量的FGAd/EGFP和HDAd/EGFP 分别体外感染A549细胞，流式细胞仪检测EGFP的表达情况，结果显示HDAd/EGFP 感染早期的A549细胞较FGAd/EGFP 有更高的荧光表达率及更高的表达强度。
　　 结论：成功构建、纯化了可表达EGFP的HDAd/EGFP载体，体外实验显示HDAd载体具有转基因瞬时高表达的特性，与FGAd相比，我们认为HDAd是一种更有价值的疫苗载体。