人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/ADR’的建立及其生物学特性的相关研究

摘要

研究目的：寻找肿瘤多药耐药以及侵袭转移的原因，进而探索治愈肿瘤的方法一直以来是国内外肿瘤学者研究的目的。在乳腺癌的多药耐药体外研究中，长期以来被广泛使用的多药耐药细胞株MCF-7/ADR近年来其真实身份却备受争议。本研究拟采用当初建立细胞株MCF-7/ADR相同的方法复制培养出一株乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/ADR’，在明确上述耐药细胞株争论真伪的同时，对其各项生物学特性进行初步研究，并进一步探讨乳腺癌多药耐药与侵袭转移之间的内在作用机制。　　 方法：1、以阿霉素低浓度加量持续诱导法，建立一株人乳腺癌多药耐药细胞模型MCF-7/ADR’，采用MTT法、免疫细胞化学染色、形态学以及连续的DNA指纹检测分析其表型和基因型，在明确与亲代细胞株MCF-7是同一起源的前提下，验证争议细胞株MCF-7/ADR的真实起源。2、通过活细胞计数、细胞克隆形成实验以及细胞周期分布检测新建的多药耐药细胞模型MCF-7/ADR’一般生物学特性的同时，以课题组前期实验结果为基础，采用免疫细胞化学染色和ALDEFLUOR分析法检测乳腺癌干细胞功能性标志物ALDH1在亲代敏感细胞株MCF-7与耐药细胞株MCF-7/ADR'中的阳性表达以及所占比例的改变，进一步揭示乳腺癌细胞耐药和肿瘤干细胞之间的关系。3、采用Transwell侵袭实验和免疫细胞化学染色进行体外论证耐药乳腺癌细胞是否伴随相应侵袭转移能力的改变，并加用P13K/AKT信号传导通路抑制剂LY294002共培养，采用荧光定量RT-PCR和Western Blot技术分析用药前和用药后、敏感与耐药细胞中pAKT、MDR1和CD44的mRNA及其蛋白的表达情况变化，进一步探讨乳腺癌细胞多药耐药与侵袭转移两大恶性表型之间的内在作用机制。　　 结果：1、利用阿霉素成功诱导建成了一株乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR'，耐药指数达86，并具有与多药耐药细胞株MCF-7/ADR类似的表型特征，如多药耐药、高表达P-gp，细胞内张力微丝和细胞表面伪足增多等。但是在基因型DNA指纹方面，经阿霉素长期诱导筛选的MCF-7/ADR’耐药细胞与亲代MCF-7细胞始终保持高度一致，却与争议的MCF-7/ADR耐药细胞截然不同。2、与亲代敏感细胞相比，新建的乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/ADR’具有群体倍增时间缩短、克隆形成能力增强、ER表达缺失等耐药细胞的一般生物学特性；而且免疫细胞化学染色和ALDEFLUOR分析结果表明，随着乳腺癌细胞逐渐耐药的同时，P-gp表达逐渐增加，ALDH1蛋白表达增加，ALDH-阳性细胞比例数明显增高(5.83％vs.0.15％，P<0.01)。3、Transwell侵袭实验显示，耐药细胞株MCF-7/ADR’穿膜细胞数明显多于敏感细胞株MCF-7，差异具有显著性(0.353±0.023 vs.0.120±0.055，P<0.05)。免疫细胞化学染色结果提示，随着耐药细胞P-gp的表达增加，CD44以及pAKT都表现出相应增高的表达趋势。进一步通过Q-RT-PCR和Western Blot检测，发现耐药细胞株MCF-7/ADR’中pAKT、MDR1(P-gp)和CD44在mRNA和蛋白水平的表达均明显高于亲代敏感细胞株MCF-7，使用PI3K通路抑制剂LY294002处理后，pAWT的表达下降明显，同时CD44和MDR1(P-gp)在细胞中的表达也都受到了不同程度的抑制。　　 结论：1、新建的阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR’具有多药耐药细胞的典型特征，而且和MCF-7同源；受争议的多药耐药细胞株MCF-7/ADR并非起源于人乳腺癌细胞株MCF-7。2、乳腺癌的多药耐药不仅包含获得性耐药细胞比例增加，同时伴有肿瘤干细胞的富集造成的内在性耐药增加。3、耐药的乳腺癌细胞伴有侵袭能力增强，P-糖蛋白、CD44和pAKT三者之间具有协同作用，PI3K信号通路可能是联系乳腺癌多药耐药和侵袭转移之间的桥梁之一。