白藜芦醇对颞叶癫痫大鼠不同发作时期海马神经元GluR6和GABAAR-α1表达量的调节作用

摘要

目的：
　　应用脑立体定位技术在大鼠海马CA3中心区通过微量注射海人草酸(kainic acid),建立颞叶癫痫大鼠模型,以此模型为基础,从行为学和分子生物学两方面观察模型动物于癫痫不同发作时期其发作频率及海马神经元GluR6和GABAR-α1表达量的变化,分析在颞叶癫痫发生、发展过程中大鼠海马神经元中 GluR6和GABAR-α1表达量变化趋势以及白藜芦醇(resveratrol,Res)对该表达量变化的调节作用,并评价其抗癫痫效果及作用机制。
　　方法：
　　1.动物模型建立雄性Wistar大鼠,体重220-260克,清洁级。水合氯醛(350mg/kg,i.p.)麻醉动物后,用脑立体定位技术在大鼠海马CA3中心区(AP:-4.0mm,ML:-4.4 mm,DV:3.8mm)缓慢注射KA2.5μl(0.4μg/μl),约10min注射完毕,留针3-5min,缝合头皮。按Racine分级法对癫痫发作程度进行分级,选发作级别达Ⅳ级以上的大鼠用于下一步实验观察。对照组大鼠在同样的脑区注射等量的生理盐水。
　　2.动物分组按癫痫不同发作时期的行为学表现对实验动物进行分组,急性期(3d)、平静期(14d)、慢性期(60d)。并根据实验要求将动物分为:生理盐水对照组(NS组)、癫痫模型组(KA组)、KA+Res治疗组(Res组,15mg/kg/d)。急性期癫痫大鼠在首次急性大发作后即通过灌胃给药,每天1次,持续3 d;静止期和慢性期癫痫大鼠在首次急性大发作后即通过灌胃给药,每天1次,持续10d。3.行为学观察将手术后的大鼠饲养于装有视频监控的动物房内,自由进食饮水,自然采光,室温维持在23oC±1oC。每天监控8h,每周监控5d,对各组大鼠进行连续视频监控,从行为表现上统计癫痫不同发作时期各组大鼠痫样发作的个体数。
　　4.Western Blot分析7％水合氯醛经腹腔注射麻醉(ml/kg)大鼠后立即断头取脑,冰上小心分离出海马,置于EP管中经-80oC冻存。用脑组织蛋白裂解液提取海马内全蛋白,利用BCA法测蛋白浓度。取样本于10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,蛋白80V恒压湿转入PVDF膜上,5%脱脂牛奶室温封闭30 min,孵一抗4 oC过夜,0.05%PBS-T洗膜3×10min,室温共同孵育二抗和HRP-GAPDH抗体1.5h,0.05%PBS-T洗膜3×10 min,暗室中ECL显色后曝光。
　　5.统计学分析采用SPSS13.0软件进行统计分析,组间差异使用单因素方差分析,组内差异使用LSD法进行比较,实验数据以x±s表示,p<0.05具有统计学差异。
　　结果：
　　1.行为学观察颞叶癫痫大鼠模型的成功率达到97.0%(62/64)。NS组未见任何形式癫痫发作;癫痫发作急性期:KA组大鼠痫样发作率为87.5%(7/8),Res组大鼠痫样发作率为75.0%(6/8);静止期:KA组大鼠痫样发作率为0(0/8)，Res组大鼠痫样发作率为0(0/8);慢性期:KA组大鼠自发发作率为87.5%(7/8),Res组大鼠自发发作率为12.5%(1/8)。
　　2.Western Blot分析与NS组大鼠相比较,在癫痫发作急性期,KA组海马神经元中GluR6和GABAAR-α1表达明显减少(n=8,p<0.05),Res组GluR6和GABAAR-α1表达有所恢复(n=8,p>0.05),但仍低于对照组。静止期,KA组海马神经元GluR6和GABAAR-α1的表达几乎检测不到(n=8,p<0.05),而Res组海马神经元GluR6和GABAAR-α1表达有所恢复,但仍然没有达到对照组水平。慢性期,KA组海马神经元GluR6和GABAAR-α1表达量明显增多(n=8,p<0.05),Res组海马神经元GluR6表达量有所恢复(n=8,p>0.05),而GABAAR-α1表达量仍明显增多(n=8,p<0.05),且明显地高出对照组。
　　结论：
　　1.Res能较强的抑制kainate诱导的颞叶癫痫大鼠的痫样自发发作,对颞叶癫痫的发生和发展具有一定的抑制作用。
　　2.Kainate诱导的颞叶癫痫大鼠在癫痫不同发作时期海马神经元GluR6和GABAAR-α1的表达会上调或下调,Res对这种变化有一定的调节作用,从而达到抗癫痫的效果。

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研究论文

白藜芦醇对颞叶癫痫大鼠不发作同时期海马神经元GluR6和GABAAR-α1表达量的调节作用

1 前 言

2 材料与方法

2.1 材 料

2.1.1 动 物

2.1.2 药品与试剂

2.1.3 仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 癫痫动物模型建立

2.2.2 动物分组

2.2.3 行为学监控

2.2.4 Western blot 分析

2.2.5 统计分析

3 结 果

3.1 行为学结果

3.1.1 癫痫发作急性期

3.1.2 癫痫发作静止期

3.1.3 癫痫发作慢性期

3.2 Res对不同癫痫大鼠发作时期海马GluR6和GABAAR-α1表达的影响

3.2.1癫痫发作急性期

3.2.2 癫痫发作静止期

3.2.3 癫痫发作慢性期

4 讨 论

4.1 GluR6表达量的变化与癫痫发生、发展的关系

4.2 GABAAR-α1表达量的变化与癫痫发生、发展的关系

4.3 Res对调节癫痫大鼠癫痫发作不同时期海马神经元GluR6和GABAAR-α1表达量的影响

5 结 论

参考文献

对本研究工作的进一步设想

附 录

致谢

综 述