白藜芦醇对颞叶癫痫大鼠癫痫不同发作时期海马和皮层氨基酸类递质释放的影响

摘要

目的：
　　 应用脑立体定位技术在大鼠海马CA3中心区通过微量注射海人草酸（kainicacid，KA），建立颞叶癫痫大鼠模型，以此模型为基础，从行为学和高效液相色谱分析两个方面观察颞叶癫痫大鼠癫痫不同发作时期痫样发作频率及海马和皮层氨基酸类递质释放水平的变化，分析颞叶癫痫发生、发展过程及白藜芦醇（resveratrol,Res）对KA诱导的颞叶癫痫大鼠海马和皮层氨基酸类递质释放的影响，进而评价其抗癫痫效果及作用机制。
　　 方法：
　　 1.模型建立雄性Wistar大鼠，体重220-260克，清洁级。水合氯醛（350mg/kg，I.p.）麻醉动物后，用脑立体定位技术在大鼠海马CA3中心区（AP：-4.0mm，ML：-4.4mm，DV：3.8mm）缓慢注射KA2.5μl（0.4μg/μl），约10min注射完毕，留针3-5min，缝合头皮。按Racine分级法对癫痫发作程度进行分级，急性发作程度达Ⅳ级以上的大鼠用于下一步药理学实验。对照组大鼠在同样的脑区注射等量的生理盐水。
　　 2.动物分组按癫痫不同发作时期对实验动物进行分组，急性期（3d）、平静期（14d）、慢性Ⅰ期（60d）及慢性Ⅱ期（60d）。将实验动物均分为：生理盐水对照组（NS组）、癫痫模型组（KA组）、KA+Res治疗组（Res组，15mg/kg/d）。急性期癫痫大鼠在首次急性大发作后即通过灌胃给药，每天1次，持续3d；静止期和慢性Ⅰ期癫痫大鼠在首次急性大发作后即通过灌胃给药，每天1次，持续10d；慢性Ⅱ期癫痫大鼠模型建立后饲养60d后再通过灌胃给药，每天1次，持续10d。
　　 3.行为学观察将手术后的大鼠饲养于装有视频监控的动物房内，自由进食饮水，自然采光，室温维持在23°C±1°C。每天监控8 h，每周监控5d，对各组大鼠进行连续视频监控，从行为表现上统计癫痫不同发作时期各组大鼠痫样发作个体数。
　　 4.高效液相色谱分析大鼠迅速断头，冰上取出海马和皮层，电动匀浆后，加3倍体积乙腈沉淀蛋白，冷冻离心，取上清，经稀释后柱前衍生进样，色谱分析；根据出峰面积及氨基酸标准曲线，计算海马和皮层中谷氨酸（glutamic acid，Glu）、甘氨酸（glycine，Gly）、γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）含量。
　　 5.统计学分析采用SPSS 13.0软件进行统计分析，组间差异使用单因素方差分析，组内差异使用LSD法进行比较，实验数据以x±s表示，p<0.05具有统计学差异。
　　 结果：
　　 1.行为学观察颞叶癫痫大鼠模型的成功率达到97.0％（62/64）。NS 组未见任何形式癫痫发作；癫痫发作急性期：KA 组大鼠痫样发作率为87.5％（7/8），Res 组大鼠痫样发作率为75.0％（6/8）；静止期：KA 组大鼠痫样发作率为0（0/8），Res组大鼠痫样发作率为0（0/8）；慢性Ⅰ期：KA 组大鼠自发发作率为87.5％（7/8），Res 组大鼠自发发作率为12.5％（1/8）；慢性Ⅱ期：KA组大鼠自发发作率约为85.7％（6/7），Res 组大鼠自发发作率约为71.4％（5/7）。
　　 2.高效液相色谱分析与NS 组大鼠相比较，癫痫发作急性期，KA 组和Res 组海马Glu/GABA 比值均明显升高（n=8，P<0.05），海马Glu/Gly 及皮层Glu/GABA,Glu/Gly 比值均无明显变化（n=8）；静止期，KA 组和Res 组海马和皮层Glu/GABA,Glu/Gly 比值均无明显变化（n=8）；慢性Ⅰ期，KA 组海马和皮层Glu/GABA和Glu/Gly 比值均明显升高（n=8，P<0.05），Res 组海马Glu/GABA和Glu/Gly 比值明显降低（n=8，P<0.05），而Res 组皮层Glu/GABA和Glu/Gly 比值仍表现明显升高（n=8，P<0.05）；慢性Ⅱ期，KA 组和Res 组皮层Glu/GABA和Glu/Gly 比值均明显升高（n=7，P<0.05）；海马Glu/GABA和Glu/Gly 比值无明显变化（n=7）。
　　 结论：
　　 1.Res 能明显地抑制KA 诱导的慢性颞叶癫痫大鼠的痫样自发发作。
　　 2.Res 对KA 诱导的颞叶癫痫大鼠癫痫不同发作时期海马兴奋性-抑制性氨基酸递质比例的失衡有一定的逆转作用。