抑制miRNA-21的表达对胆管癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响及其靶基因的探讨

摘要

胆管癌是常见的胆道恶性肿瘤之一,其恶性程度高,且发病隐匿,早期诊断困难,手术切除率低。近年研究发现多种MicroRNA(miRNA)的表达异常与肿瘤的发生发展密切相关。其中,miRNA-21在胆管癌组织中呈高表达并起着癌基因的作用。本研究通过抑制人胆管癌细胞RBE中miRNA-21的表达,观察RBE细胞增殖、凋亡及侵袭的变化,并进一步探讨miRNA-21在RBE细胞中的作用机制。
　　目的:通过转染miRNA-21抑制剂,抑制人胆管癌细胞株RBE细胞miRNA-21的表达,观察RBE细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学行为的变化,并探讨miRNA-21在胆管癌细胞中可能调控的靶基因及其作用机制。
　　方法:以人胆管癌细胞RBE细胞为研究对象,根据处理方法不同,细胞分为四组:正常细胞组(cell组)、脂质体组(仅予脂质体,lipo组)、阴性对照组(转染无关序列, miRNA-21-NC)、miRNA-21抑制组(转染 miRNA-21抑制剂,miRNA-21-IN)。经荧光定量PCR证实转染成功后,应用MTT方法检测细胞增殖活性的变化,应用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化,通过Transwell侵袭实验检测细胞侵袭力的改变,通过荧光定量PCR技术及蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测RBE细胞中RECK,maspin mRNA及蛋白表达的改变。
　　结果:miRNA-21在经转染miRNA-21抑制剂后在RBE细胞中的表达得到有效抑制,荧光定量PCR结果显示与正常细胞相比,其表达下降了0.0014倍。MTT结果显示RBE细胞在抑制miRNA-21表达后增殖活性明显受到抑制(P＜0.05),流式细胞仪结果显示各组细胞凋亡率分别为2.29％(cell),2.43%(lipo),2.89%(miRNA-21-NC),19.35%(miRNA-21-IN), miRNA-21的表达降低后,RBE细胞的凋亡率明显增高(P＜0.05),各组细胞Transwell小室显微镜下细胞计数分别为:54.0±2.1(cell),45.4±3.2(lipo),40.8±2.4(miRNA-21-NC),19.2±1.5(miRNA-21-IN),实验组 RBE细胞相对于对照组其侵袭力明显下降(P＜0.05)并且荧光定量 PCR及western blot结果显示在miRNA-21抑制后,RECK, maspin mRNA及其蛋白的表达明显上调(P＜0.05)。
　　结论:通过抑制miRNA-21的表达可抑制RBE细胞的增值,促进RBE细胞的凋亡,降低RBE细胞的侵袭力,RECK及 maspin作为miRNA-21的靶基因参与调控过程。

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1前言

2材料

2.1生物材料

2.2主要仪器

2.3 主要试剂

3 实验方法

3.1 细胞培养

2.4 主要溶液的配制

3.2 实验分组

3.3 细胞转染

3.4 转染效果的验证（荧光定量RT-PCR法检测miRNA-21）

3.5 MTT检测细胞增殖活性

3.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

3.7 Transwell小室检测细胞侵袭力

3.9 RECK, maspin蛋白含量检测（Western Blot法）

3.10 统计学处理

4 结果

4.1荧光定量RT-PCR检测转染后miRNA-21表达情况

4.2 MTT检测细胞增殖活性

4.3 流式细胞仪检测细胞凋亡

4.4 Transwell侵袭实验

4.5 RECK、maspin mRNA表达改变

4.6 RECK、maspin蛋白表达改变

6 结论

参考文献

附录

致谢

综述