大鼠EGF、CNTF真核表达载体的构建及其体外表达

摘要

目的:分别构建大鼠pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF真核表达质粒,并检测其在cos-7细胞中的共表达,为下一步进行基因治疗脊髓损伤提供实验基础。
　　方法:①pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF真核表达载体的构建及鉴定:3周龄SD大鼠一只脱颈处死后,在无菌、无RNA酶污染、冰冷的条件下利用Trizol试剂提取出大鼠颌下腺及坐骨神经组织总RNA。利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别扩增出EGF及CNTF基因功能片段,电泳分析结束后回收纯化PCR产物,回收产物分别与空白质粒pSecTag2/Hygro B同时进行BamHⅠ和Hind双酶切,两组酶切产物经T4 DNA连接酶作用后,分别转化入感受态大肠杆菌JM109,LB琼脂平板培养过夜。经PCR初筛,两组阳性克隆分别行BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序,测序结果使用BLAST软件与GeneBank数据库进行同源性分析。
　　②cos-7细胞的转染和重组大鼠EGF、CNTF蛋白的表达及检测:取纯化的重组质粒pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF,在脂质体试剂LipofectamineTM2000的作用下分别单独及共转染cos-7细胞。转染48h后分别收集三组细胞培养液,Western blot鉴定重组EGF、CNTF蛋白在cos-7细胞各组中的表达情况。
　　结果:①逆转录聚合酶链反应成功获得大鼠EGF及CNTF cDNA功能片段。随机挑选两组各10个重组真核表达载体的克隆,聚合酶链反应筛选出两组阳性克隆各2个,经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组质粒构建成功。
　　②两种质粒在脂质体介导下分别单独及共转染转染cos-7细胞48h后,Western blot鉴定重组EGF、CNTF蛋白在三组cos-7细胞中的表达,分别在6kDa和22kDa处出现阳性条带。
　　结论:大鼠EGF、CNTF基因的真核表达载体 pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF构建成功。共转染cos-7细胞后能够共表达重组EGF、CNTF蛋白。

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1.前言

2. 对象与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结 果

3.1 pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/hygro B-CNTF 真核表达载体的构建

3.2 cos-7细胞的转染和重组大鼠EGF、CNTF蛋白的表达及检测

4 讨 论

4.1 内源性神经干细胞治疗脊髓损伤的研究进展

4.2 脊髓损伤后星形胶质细胞的变化及作用

4.3 基因载体的选择

4.4 表皮生长因子在脊髓损伤后的作用及变化

4.5 睫状神经营养因子在脊髓损伤后的作用

4.6基因辅助治疗脊髓损伤的必要性

4.7 进一步的研究方向

5 结论

参考文献

附 录

致谢

综述